Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2

Das Severe Acute Respiratory^{Syndrome Coronavirus} 2 (SARS-CoV-2) ist ein umhülltes, positiv-sense, einzelsträngiges RNA-Virus, das zur Betacoronavirus-Linie in der Familie der Coronaviridae 1 gehört. Diese virale Familie ist in Alpha-, Beta-, Gamma- und Delta-Coronavirus¹ unterteilt. Alpha- und Betacoronaviren infizieren hauptsächlich Säugetiere, während Gamma- und Deltacoronaviren fast ausschließlich Vögel infizieren². Bisher haben sieben Coronaviren (CoV) Artenbarrieren überschritten und sind als humane Coronaviren (HCoV) entstanden: zwei Alpha-CoVs (HCoV-229E und HCoV-NL63) und fünf Beta-CoVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Middle East respiratory syndrome coronavirus [MERS-CoV] und SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV und SARS-CoV-2 sind hochpathogen und verursachen eine schwere Infektion der unteren Atemwege⁷. Vor der Entstehung von SARS-CoV-2 gab es zwei durch CoVs verursachte epidemische Ausbrüche: SARS-CoV in Guangdong Providence, China, von 2002-2003, mit einer Todesfallrate (CFR) von etwa 9,7%; und MERS-CoV im Nahen Osten von 2012 bis heute, mit einem CFR von etwa 34%^7,8. SARS-CoV-2 hat einen Gesamt-CFR zwischen 3,4% und 49%, wobei die zugrunde liegenden Bedingungen zu einem höheren CFR^{von 8,9} beitragen. Seit seiner Entdeckung im Dezember 2019 in Wuhan, China, ist SARS-CoV-2 für über 242 Millionen Infektionen beim Menschen und mehr als 4,9 Millionen Todesfälle bei Menschen weltweit^{verantwortlich} 7,10,11,12. Insbesondere seit Ende ²⁰²⁰ haben neue SARS-CoV-2-Varianten der Besorgnis (VoC) und Varianten von Interesse (VoI) die Virusmerkmale, einschließlich Übertragung und Antigenität ^9,13, und die allgemeine Richtung der COVID-19-Pandemie beeinflusst. Für die Behandlung von SARS-CoV-2-Infektionen gibt es derzeit nur eine US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) therapeutisches antivirales (Remdesivir) und ein Emergency Use Authorization (EUA) Medikament (Baricitinib, in Kombination mit Remdesivir zu verabreichen⁾¹⁴. Es gibt auch 6 zugelassene monoklonale EUA-Antikörper: REGEN-COV (Casirivimab und Imdevimab, zusammen verabreicht), Sotrovimab, Tocilizumab und Bamlanivimab und Etesevimab, die zusammen^{verabreicht werden 15,16,17,18,19}. Derzeit gibt es nur einen von der FDA zugelassenen prophylaktischen Impfstoff, Pfizer-BioNTech, und zwei weitere prophylaktische Impfstoffe (Moderna und Janssen) wurden^von der EUA zugelassen 20,21,22,23,24. Mit der unkontrollierten Infektionsrate und dem Aufkommen von VoC und VoI stellt SARS-CoV-2 jedoch immer noch eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar. Daher sind dringend neue Ansätze erforderlich, um effiziente Prophylaxe- und Therapeutika zur Kontrolle der SARS-CoV-2-Infektion und der noch anhaltenden COVID-19-Pandemie zu identifizieren.

Die Untersuchung von SARS-CoV-2 erfordert aufwändige Techniken und sekundäre Ansätze, um das Vorhandensein des Virus in infizierten Zellen und/oder validierten Tiermodellen der Infektion zu identifizieren. Die Verwendung der umgekehrten Genetik hat es ermöglicht, rekombinante Viren zu erzeugen, um wichtige Fragen in der Biologie von Virusinfektionen zu beantworten. Zum Beispiel haben Techniken der umgekehrten Genetik Mittel zur Verfügung gestellt, um die Mechanismen von Virusinfektionen, Pathogenese und Krankheiten aufzudecken und zu verstehen. Ebenso haben Ansätze der Reverse Genetik den Weg geebnet, rekombinante Viren ohne virale Proteine zu entwickeln, um ihren Beitrag zur viralen Pathogenese zu verstehen. Darüber hinaus wurden Techniken der Umkehrgenetik eingesetzt, um rekombinante Viren zu erzeugen, die Reportergene für In-vitro- und In-vivo-Anwendungen exprimieren, einschließlich der Identifizierung prophylaktischer und/oder therapeutischer Ansätze zur Behandlung von Virusinfektionen. Fluoreszierende und biolumineszierende Proteine sind aufgrund ihrer Empfindlichkeit, Stabilität und einfachen Detektion aufgrund der Verbesserung neuer Technologien die am häufigsten verwendeten Reportergene^25,26. In vitro hat sich gezeigt, dass fluoreszierende Proteine als bessere Option für die Lokalisierung von Viren in infizierten Zellen dienen, während Luciferasen für Quantifizierungsstudien bequemer sind^27,28,29. In vivo werden Luciferasen gegenüber fluoreszierenden Proteinen für die Bildgebung ganzer Tiere bevorzugt, während fluoreszierende Proteine für die Identifizierung infizierter Zellen oder Ex-vivo-Bildgebung 30,31,32 bevorzugt werden. Die Verwendung von Reporter-exprimierenden rekombinanten Viren hat in vielen Familien als leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Viren gedient, darunter Flaviviren, Enteroviren, Alphaviren, Lentiviren, Arenaviren und Influenzaviren 28,33,34,35,36.

Um den Bedarf an sekundären Ansätzen zur Untersuchung von SARS-CoV-2 und zur Charakterisierung der Echtzeit-SARS-CoV-2-Infektion in vivo zu überwinden, haben wir replikationskompetente rekombinante (r)SARS-CoV-2-Proteine erzeugt, die biolumineszierende (Nanoluciferase, Nluc) oder fluoreszierende (Venus) Proteine unter Verwendung unserer zuvor beschriebenen bakteriellen künstlichen Chromosomen (BAC) -basierten umgekehrten Genetik exprimieren, die als eine einzige Kopie in E. coli beibehalten werden. um die Toxizität von Virussequenzen während ihrer Ausbreitung in Bakterien^{zu minimieren 37,38}. Insbesondere rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus zeigten in vivo eine rSARS-CoV-2/WT-ähnliche Pathogenität. Die hohe Venusexpression von rSARS-CoV-2/Venus ermöglichte den Nachweis einer Virusinfektion in der Lunge infizierter transgener K18 hACE2-Mäuse mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS)³⁹. Die Spiegel der Venusexpression korrelierten gut mit viralen Titern, die in der Lunge nachgewiesen wurden, was die Machbarkeit der Verwendung der Venusexpression als gültiger Ersatz der SARS-CoV-2-Infektion zeigt. Mit rSARS-CoV-2/Nluc konnten wir die Dynamik der Virusinfektion in Echtzeit verfolgen und die SARS-CoV-2-Infektion in vivo mit dem gleichen IVIS-Ansatz bei transgenen K18-hACE2-Mäusen longitudinal bewerten.