Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is een omhuld, positief,enkelstrengs RNA-virus dat behoort tot de Betacoronavirus-afstamming in de Coronaviridae-familie ¹. Deze virale familie is onderverdeeld in Alpha-, Beta-, Gamma- en Delta-coronavirus¹. Alfa- en Betacoronavirussen infecteren voornamelijk zoogdieren, terwijl Gamma- en Deltacoronavirus bijna uitsluitend vogels infecteren². Tot op heden hebben zeven coronavirussen (CoV) soortenbarrières overschreden en zijn ze naar voren gekomen als menselijke coronavirussen (HCoV): twee alfa-CoV’s (HCoV-229E en HCoV-NL63) en vijf bèta-CoV’s (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Midden-Oosten respiratoir syndroom coronavirus [MERS-CoV] en SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV en SARS-CoV-2 zijn hoogpathogeen en veroorzaken ernstige infectie van de onderste luchtwegen⁷. Voorafgaand aan de opkomst van SARS-CoV-2 waren er twee epidemische uitbraken veroorzaakt door CoV’s: SARS-CoV in Guangdong Providence, China, van 2002-2003, met een sterftecijfer (CFR) van ongeveer 9,7%; en MERS-CoV in het Midden-Oosten van 2012 tot heden, met een CFR van ongeveer 34%^7,8. SARS-CoV-2 heeft een totale CFR tussen 3,4%-49%, waarbij onderliggende aandoeningen bijdragen aan een hogere CFR ^8,9. Sinds de ontdekking in december 2019 is SARS-CoV-2 in Wuhan, China, verantwoordelijk voor meer dan 242 miljoen menselijke infecties en meer dan 4,9 miljoen menselijke sterfgevallen wereldwijd 7,10,11,12. Met name sinds eind 2020 hebben nieuwe SARS-CoV-2-varianten van bezorgdheid (VoC) en varianten van belang (VoI) invloed gehad op viruskenmerken, waaronder transmissie en antigeniciteit ^9,13, en de algemene richting van de COVID-19-pandemie. Voor de behandeling van SARS-CoV-2-infecties is er momenteel slechts één Verenigde Staten (VS) Food and Drug Administration (FDA) therapeutisch antiviraal (remdesivir) en één Emergency Use Authorization (EUA) geneesmiddel (baricitinib, toe te dienen in combinatie met remdesivir)¹⁴. Er zijn ook 6 goedgekeurde EUA monoklonale antilichamen: REGEN-COV (casirivimab en imdevimab, samen toegediend), sotrovimab, tocilizumab en bamlanivimab en etesevimab samen toegediend 15,16,17,18,19. Er is momenteel slechts één door de FDA goedgekeurd profylactisch vaccin, Pfizer-BioNTech, en twee andere profylactische vaccins (Moderna en Janssen) zijn EUA goedgekeurd 20,21,22,23,24. Met de ongecontroleerde infectiegraad en de opkomst van VoC en VoI vormt SARS-CoV-2 echter nog steeds een bedreiging voor de menselijke gezondheid. Daarom zijn nieuwe benaderingen dringend nodig om efficiënte profylactica en therapeutica te identificeren om SARS-CoV-2-infectie en de nog steeds lopende COVID-19-pandemie onder controle te houden.

Het bestuderen van SARS-CoV-2 vereist moeizame technieken en secundaire benaderingen om de aanwezigheid van het virus in geïnfecteerde cellen en / of gevalideerde diermodellen van infectie te identificeren. Het gebruik van omgekeerde genetica heeft het mogelijk gemaakt om recombinante virussen te genereren om belangrijke vragen in de biologie van virale infecties te beantwoorden. Omgekeerde geneticatechnieken hebben bijvoorbeeld middelen geboden om de mechanismen van virale infectie, pathogenese en ziekte te ontdekken en te begrijpen. Evenzo hebben omgekeerde geneticabenaderingen de weg vrijgemaakt om recombinante virussen te manipuleren die geen virale eiwitten hebben om hun bijdrage aan virale pathogenese te begrijpen. Daarnaast zijn omgekeerde geneticatechnieken gebruikt om recombinante virussen te genereren die reportergenen tot expressie brengen voor in vitro en in vivo toepassingen, waaronder het identificeren van profylactische en / of therapeutische benaderingen voor de behandeling van virale infecties. Fluorescerende en bioluminescente eiwitten zijn de meest gebruikte reportergenen vanwege hun gevoeligheid, stabiliteit en eenvoudige detectie op basis van de verbetering van nieuwe technologieën^25,26. In vitro is aangetoond dat fluorescerende eiwitten dienen als een betere optie voor de lokalisatie van virussen in geïnfecteerde cellen, terwijl luciferasen handiger zijn voor kwantificeringsstudies 27,28,29. In vivo hebben luciferasen de voorkeur boven fluorescerende eiwitten voor beeldvorming van hele dieren, terwijl fluorescerende eiwitten de voorkeur hebben voor de identificatie van geïnfecteerde cellen of ex vivo beeldvorming 30,31,32. Het gebruik van reporter-expresserende recombinante virussen heeft gediend als een krachtig hulpmiddel voor de studie van virussen in veel families, waaronder flavivirussen, enterovirussen, alfavirussen, lentivirussen, arenavirussen en influenzavirussen 28,33,34,35,36.

Om de behoefte aan secundaire benaderingen voor het bestuderen van SARS-CoV-2 en het karakteriseren van real-time SARS-CoV-2-infectie in vivo te overwinnen, hebben we replicatie-competente recombinant (r) SARS-CoV-2 gegenereerd die bioluminescente (nanoluciferase, Nluc) of fluorescerende (Venus) eiwitten tot expressie brengt met behulp van onze eerder beschreven bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC) -gebaseerde omgekeerde genetica, die als een enkele kopie in E. coli worden onderhouden om de toxiciteit van virussequenties tijdens de verspreiding ervan in bacteriën tot een minimum te ^{beperken 37,38}. Met name rSARS-CoV-2/Nluc en rSARS-CoV-2/Venus vertoonden rSARS-CoV-2/WT-achtige pathogeniciteit in vivo. Het hoge niveau van Venus-expressie van rSARS-CoV-2 / Venus maakte het mogelijk om virale infectie in de longen van geïnfecteerde K18 hACE2 transgene muizen te detecteren met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS)³⁹. De niveaus van Venus-expressie correleerden goed met virale titers gedetecteerd in de longen, wat de haalbaarheid aantoont van het gebruik van Venus-expressie als een geldig surrogaat van SARS-CoV-2-infectie. Met behulp van rSARS-CoV-2/Nluc konden we de dynamiek van virale infecties in realtime volgen en SARS-CoV-2-infectie in vivo longitudinaal beoordelen met dezelfde IVIS-benadering in K18 hACE2 transgene muizen.