التصوير الحي والقياس الكمي للعدوى الفيروسية في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 باستخدام SARS-CoV-2 المؤتلف الذي يعبر عنه المراسل
Summary
يصف هذا البروتوكول ديناميكيات الالتهابات الفيروسية باستخدام الفئران المؤتلفة (r) SARS-CoV-2 المعبرة عن اللوسيفيراز والتألق وأنظمة التصوير في الجسم الحي (IVIS) في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 للتغلب على الحاجة إلى النهج الثانوية المطلوبة لدراسة عدوى SARS-CoV-2 في الجسم الحي.
Abstract
تسببت جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) في فيروس كورونا 2 المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2). وحتى الآن، كان SARS-CoV-2 مسؤولا عن أكثر من 242 مليون إصابة وأكثر من 4.9 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم. على غرار الفيروسات الأخرى ، تتطلب دراسة SARS-CoV-2 استخدام طرق تجريبية للكشف عن وجود الفيروس في الخلايا المصابة و / أو في النماذج الحيوانية. للتغلب على هذا القيد ، قمنا بإنشاء مؤتلف مختص بالنسخ المتماثل (r) SARS-CoV-2 الذي يعبر عن البروتينات الحيوية (nanoluciferase ، Nluc) أو الفلورسنت (Venus). تسمح هذه المراسلات التي تعبر عن rSARS-CoV-2 بتتبع الالتهابات الفيروسية في المختبر وفي الجسم الحي بناء على التعبير عن جينات مراسل Nluc و Venus. تصف الدراسة هنا استخدام rSARS-CoV-2 / Nluc و rSARS-CoV-2 / Venus للكشف عن عدوى SARS-CoV-2 وتتبعها في نموذج الفأر المحول للأنجيوتنسين البشري K18 الموصوف سابقا 2 (hACE2) للعدوى باستخدام أنظمة التصوير في الجسم الحي (IVIS). هذا rSARS-CoV-2 / Nluc و rSARS-CoV-2 / Venus تظهر الإمراض الشبيهة ب rSARS-CoV-2 / WT والتكاثر الفيروسي في الجسم الحي. الأهم من ذلك ، أن تعبير Nluc و Venus يسمح لنا بتتبع الالتهابات الفيروسية مباشرة في الجسم الحي والجسم الحي السابق ، في الفئران المصابة. تمثل هذه rSARS-CoV-2 / Nluc و rSARS-CoV-2 / Venus خيارا ممتازا لدراسة بيولوجيا SARS-CoV-2 في الجسم الحي ، لفهم العدوى الفيروسية ومرض COVID-19 المرتبط بها ، وتحديد العلاجات الوقائية و / أو العلاجية الفعالة لمكافحة عدوى SARS-CoV-2.
Introduction
فيروس كورونا 2 المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2) هو فيروس RNA مغلف ، إيجابي الحس ، أحادي الخيط ينتمي إلى سلالة Betacoronavirus في عائلة Coronaviridae 1. تنقسم هذه العائلة الفيروسية إلى ألفا وبيتا وجاما ودلتا فيروس كورونا1. تصيب فيروسات ألفا وبيتا كورونا الثدييات بشكل رئيسي ، في حين أن فيروس جاما ودلتا يصيب الطيور بشكل حصري تقريبا2. حتى الآن، عبرت سبعة فيروسات تاجية حواجز الأنواع وظهرت كفيروسات تاجية بشرية (HCoV): اثنان من فيروسات ألفا (HCoV-229E و HCoV-NL63) وخمسة فيروسات بيتا (HCoV-OC43 و HCoV-HKU1 و SARS-CoV وفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية [MERS-CoV] و SARS-CoV-2) 3,4,5,6. SARS-CoV و MERS-CoV و SARS-CoV-2 شديدة الإمراض ، مما يسبب عدوى حادة في الجهاز التنفسي السفلي7. وقبل ظهور السارس – كوف-2، كانت هناك فاشيتان وبائيتان ناجمتان عن فيروس كورونا المستجد (سارس) في قوانغدونغ بروفيدانس، الصين، في الفترة من 2002 إلى 2003، بمعدل إماتة للحالات بلغ حوالي 9.7 في المائة؛ وفاشيات وبائية في قوانغدونغ بروفيدانس بالصين، في الفترة من 2002 إلى 2003، بلغ معدل إماتة الحالات حوالي 9.7 في المائة؛ وفاشيات وباء في قوانغدونغ بروفيدانس بالصين، في الفترة من 2002 إلى 2003، حيث بلغ معدل إماتة الحالات حوالي 9.7 في المائة؛ وفاشيات وباء في قوانغدونغ بروفيدانس بالصين، في الفترة من 2002 إلى 2003؛ وفاشية وباء في قوانغدونغ بروفيدانس بالصين، في الفترة من 2 وفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية في الشرق الأوسط من عام 2012 إلى الوقت الحاضر، حيث بلغت نسبة CFR حوالي 34٪ 7,8. يحتوي SARS-CoV-2 على CFR إجمالي يتراوح بين 3.4٪ -49٪ ، مع مساهمة الظروف الأساسية في ارتفاع CFR 8,9. منذ اكتشافه في ديسمبر 2019 ، في ووهان ، الصين ، كان SARS-CoV-2 مسؤولا عن أكثر من 242 مليون إصابة بشرية وأكثر من 4.9 مليون حالة وفاة بشرية في جميع أنحاء العالم 7,10,11,12. ومن الجدير بالذكر أنه منذ أواخر عام 2020، أثرت المتغيرات الجديدة المثيرة للقلق من SARS-CoV-2 (VoC) والمتغيرات ذات الأهمية (VoI) على خصائص الفيروس، بما في ذلك انتقال العدوى والمستضدات 9,13، والاتجاه العام لجائحة كوفيد-19. لعلاج عدوى SARS-CoV-2 ، لا يوجد حاليا سوى ولاية أمريكية واحدة (الولايات المتحدة) إدارة الغذاء والدواء (FDA) العلاجية المضادة للفيروسات (ريمديسيفير) ودواء واحد ترخيص الاستخدام الطارئ (EUA) (baricitinib ، ليتم إعطاؤه بالاشتراك مع ريمديسيفير)14. هناك أيضا 6 أجسام مضادة وحيدة النسيلة معتمدة من EUA: REGEN-COV (casirivimab و imdevimab ، تدار معا) ، sotrovimab ، tocilizumab ، و bamlanivimab و etesevimab تدار معا15،16،17،18،19. لا يوجد حاليا سوى لقاح وقائي واحد معتمد من إدارة الأغذية والعقاقير ، Pfizer-BioNTech ، واثنين من اللقاحات الوقائية الأخرى (Moderna و Janssen) تمت الموافقة عليهما من EUA20،21،22،23،24. ومع ذلك ، مع معدل العدوى غير المنضبط وظهور VoC و VoI ، لا يزال SARS-CoV-2 يشكل تهديدا لصحة الإنسان. لذلك، هناك حاجة ماسة إلى نهج جديدة لتحديد الوقاية والعلاجات الفعالة للسيطرة على عدوى SARS-CoV-2 وجائحة COVID-19 التي لا تزال مستمرة.
تتطلب دراسة SARS-CoV-2 تقنيات شاقة ومناهج ثانوية لتحديد وجود الفيروس في الخلايا المصابة و / أو النماذج الحيوانية المصادق عليها للعدوى. سمح استخدام علم الوراثة العكسي لتوليد الفيروسات المؤتلفة بالإجابة على أسئلة مهمة في بيولوجيا الالتهابات الفيروسية. على سبيل المثال، وفرت تقنيات الوراثة العكسية وسائل للكشف عن آليات العدوى الفيروسية والإمراض والمرض وفهمها. وبالمثل، مهدت مناهج علم الوراثة العكسي الطريق لهندسة الفيروسات المؤتلفة التي تفتقر إلى البروتينات الفيروسية لفهم مساهمتها في التسبب الفيروسي. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت تقنيات علم الوراثة العكسية لتوليد فيروسات مؤتلفة تعبر عن جينات مراسلة للتطبيقات المختبرية والحيوية، بما في ذلك تحديد النهج الوقائية و/أو العلاجية لعلاج الالتهابات الفيروسية. البروتينات الفلورية والمضيئة الحيوية هي الجينات الصحفية الأكثر استخداما بسبب حساسيتها واستقرارها وسهولة اكتشافها بناء على تحسين التقنيات الجديدة25,26. في المختبر ، ثبت أن البروتينات الفلورية تعمل كخيار أفضل لتوطين الفيروسات في الخلايا المصابة ، في حين أن luciferases أكثر ملاءمة لدراسات القياس الكمي27،28،29. في الجسم الحي ، يفضل luciferases على البروتينات الفلورية للتصوير الحيواني الكامل ، في حين يفضل البروتينات الفلورية لتحديد الخلايا المصابة أو التصوير خارج الجسم الحي 30،31،32. كان استخدام الفيروسات المؤتلفة التي يعبر عنها المراسلون بمثابة أداة قوية لدراسة الفيروسات في العديد من العائلات ، بما في ذلك ، من بين أمور أخرى ، فيروسات فلافي ، والفيروسات المعوية ، والفيروسات ألفا ، وفيروسات lentivirus ، وفيروسات الساحة ، وفيروسات الأنفلونزا28،33،34،35،36.
للتغلب على الحاجة إلى نهج ثانوية لدراسة SARS-CoV-2 وتوصيف عدوى SARS-CoV-2 في الوقت الفعلي في الجسم الحي ، قمنا بإنشاء مؤتلف مختص بالنسخ المتماثل (r) SARS-CoV-2 الذي يعبر عن البروتينات الحيوية (nanoluciferase ، Nluc) أو الفلورسنت (Venus) باستخدام علم الوراثة العكسي القائم على الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BAC) الموصوفة سابقا ، والتي يتم الاحتفاظ بها كنسخة واحدة في E. coli من أجل تقليل سمية تسلسل الفيروسات أثناء انتشارها في البكتيريا37,38. ومن الجدير بالذكر أن rSARS-CoV-2/Nluc و rSARS-CoV-2/Venus أظهرا إمراضا شبيها ب rSARS-CoV-2/WT في الجسم الحي. سمح المستوى العالي من تعبير الزهرة من rSARS-CoV-2 / Venus باكتشاف العدوى الفيروسية في رئتي الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 المصابة باستخدام نظام تصوير في الجسم الحي (IVIS)39. ارتبطت مستويات تعبير كوكب الزهرة بشكل جيد مع العيار الفيروسي المكتشف في الرئتين ، مما يدل على جدوى استخدام تعبير الزهرة كبديل صالح لعدوى SARS-CoV-2. باستخدام rSARS-CoV-2 / Nluc ، تمكنا من تتبع ديناميكيات العدوى الفيروسية في الوقت الفعلي وتقييم عدوى SARS-CoV-2 طوليا في الجسم الحي باستخدام نفس نهج IVIS في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوضح هذا البروتوكول جدوى استخدام هذه الجينات rSARS-CoV-2 التي تعبر عن جينات المراسل لمراقبة العدوى الفيروسية في الجسم الحي. يوفر كل من الفيروسات المؤتلفة التي يعبر عنها المراسل أداة ممتازة لدراسة عدوى SARS-CoV-2 في الجسم الحي. تمثل أنظمة التصوير خارج الجسم الحي الموصوفة (rSARS-CoV-2 / Venus) <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الأعضاء في معهدنا (معهد تكساس للبحوث الطبية الحيوية) على جهودهم في الحفاظ على تشغيل منشآتنا بالكامل وآمنة خلال جائحة COVID-19. ونود أيضا أن نشكر لجنتنا المؤسسية للسلامة الأحيائية (IBC) و spell (IACUC) على مراجعة بروتوكولاتنا بطريقة فعالة من حيث الوقت. نشكر الدكتور توماس موران في كلية إيكان للطب في ماونت سيناي على توفير الجسم المضاد أحادي النسيلة للبروتين أحادي النسيلة 1C7C7 التفاعلي 1C7C7 (N). يتم دعم أبحاث SARS-CoV-2 في مختبر مارتينيز سوبريدو حاليا من خلال منح NIAID / NIH RO1AI161363-01 و RO1AI161175-01A1 و R43AI165089-01 ؛ تمنح وزارة الدفاع (DoD) W81XWH2110095 و W81XWH2110103 ؛ شراكة سان أنطونيو من أجل العلاج الدقيق؛ منتدى معهد تكساس للبحوث الطبية الحيوية؛ مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو ؛ مؤسسة سان أنطونيو الطبية؛ ومن قبل مركز البحوث المتعلقة بإمراض الأنفلونزا وانتقالها (CRIPT) ، وهو مركز للتميز في أبحاث الأنفلونزا والاستجابة لها تموله NIAID (CEIRR ، العقد رقم 75N93021C00014).
Materials
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at room temperature (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Image analysis software | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
| MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
| MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit |
References
- V’Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
- Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
- Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
- Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
- Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
- Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
- Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
- Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
- Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
- Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020).
- Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).
- Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
- . Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19 Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021)
- Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
- Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
- Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
- Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
- O’Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
- Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 – Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
- Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
- Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
- Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine – United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
- Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine – United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
- Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
- Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
- Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
- Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
- Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
- Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
- Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
- Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
- Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
- Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
- Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
- Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , (2011).
- Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).
