인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석
1Department of Clinical Medicine (K1),University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases,Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine,Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling
Summary
이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.
Abstract
미토콘드리아는 많은 신경 퇴행성 질환의 병태생리학에서 중요하다. 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위 (MMP), 활성 산소 종 (ROS)의 미토콘드리아 생산 및 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 복제 수의 변화는 종종 이러한 과정의 특징입니다. 이 보고서는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 및 iPSC 유래 신경 및 신경교 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 여러 미토콘드리아 매개변수를 측정하기 위한 새로운 유세포 분석 기반 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이 흐름 기반 전략은 살아있는 세포를 사용하여 미토콘드리아 부피, MMP 및 ROS 수준을 측정하고 고정 세포를 사용하여 미토콘드리아 호흡 사슬(MRC) 및 미토콘드리아 전사 인자 A(TFAM)와 같은 mtDNA 관련 단백질의 구성 요소를 추정합니다.
MitoTracker Green(MTG), 테트라메틸로다민 에틸 에스테르(TMRE) 및 MitoSox Red를 포함한 형광 리포터와의 공동 염색을 통해 미토콘드리아 부피, MMP 및 미토콘드리아 ROS의 변화를 정량화하고 미토콘드리아 함량과 관련시킬 수 있습니다. MRC 복합체 서브유닛 및 외부 미토콘드리아 막 20(TOMM20)의 트랜스로카제에 대한 항체를 이용한 이중 염색은 MRC 서브유닛 발현의 평가를 허용한다. TFAM의 양은 mtDNA 복제 수에 비례하므로 TOMM20 당 TFAM의 측정은 미토콘드리아 부피 당 mtDNA의 간접적 인 측정을 제공합니다. 전체 프로토콜은 2-3 시간 내에 수행 할 수 있습니다. 중요하게도, 이러한 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 미토콘드리아 부피 당 전체 수준과 특정 수준 모두에서 미토콘드리아 매개 변수를 측정 할 수 있습니다.
Introduction
미토콘드리아는 거의 모든 진핵 세포에 존재하는 필수 세포 기관입니다. 미토콘드리아는 산화적 인산화를 통해 아데노신 삼인산(ATP)을 생성하여 에너지 공급을 담당하고 생합성 및 대사를 위한 대사 매개체 역할을 합니다. 미토콘드리아는 ROS 생성, 세포 사멸 및 세포 내Ca2+ 조절과 같은 다른 많은 중요한 세포 과정에 깊이 관여합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨병(PD), 알츠하이머병(AD), 헌팅턴병(HD), 프리드라이히 운동실조증(FRDA) 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)1을 비롯한 다양한 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다. 증가된 미토콘드리아 기능 장애 및 mtDNA 이상도 인간의 노화에 기여하는 것으로 생각됩니다 2,3.
다양한 유형의 미토콘드리아 기능 장애가 신경 퇴행성 질환에서 발생하며 미토콘드리아 부피의 변화, MMP 탈분극, ROS 생성 및 mtDNA 복제 수의 변화가 일반적입니다 4,5,6,7. 따라서 이러한 기능 및 기타 미토콘드리아 기능을 측정하는 능력은 질병 메커니즘을 연구하고 잠재적 인 치료제를 테스트 할 때 매우 중요합니다. 더욱이, 인간 신경퇴행성 질환을 충실하게 복제하는 동물 모델의 부족을 고려할 때, 뇌 세포에서 인간 질병을 요약하는 적절한 시험관내 모델 시스템을 확립하는 것은 이러한 질병에 대한 더 큰 이해와 새로운 치료법의 개발을 향한 중요한 단계입니다 2,3,8,9.
인간 iPSC는 뉴런 및 비뉴런 세포(즉, 신경교 세포)를 비롯한 다양한 뇌 세포를 생성하는데 사용될 수 있으며, 신경퇴행성 질환과 관련된 미토콘드리아 손상은 두 세포 유형 3,10,11,12,13 모두에서 발견되었다. 신경 및 신경교 계통으로의 iPSC 분화를 위한 적절한 방법이 이용가능하다14,15,16. 이 세포는 시험관 내 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 고유한 인간/환자 플랫폼을 제공합니다. 또한 환자에서 파생되기 때문에 iPSC 유래 뉴런과 신경교 세포는 인간에서 일어나는 일을보다 정확하게 반영하는 질병 모델을 제공합니다.
현재까지 iPSC, 특히 살아있는 뉴런과 신경교 세포에서 여러 미토콘드리아 기능 파라미터를 측정하는 편리하고 신뢰할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 유세포 분석의 사용은 과학자에게 단일 세포에서 미토콘드리아 기능을 포함한 생물학적 매개 변수를 측정하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 iPSC의 신경 줄기 세포(NSC), 뉴런 및 신경교 성상세포를 포함한 다양한 유형의 뇌 세포 생성에 대한 세부 정보와 iPSC 및 iPSC 유래 신경 및 신경교 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 여러 미토콘드리아 매개변수를 측정하는 새로운 유세포 분석 기반 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 유세포분석을 사용하여 미토콘드리아 부피, MMP, 미토콘드리아 ROS 수준, MRC 복합체 및 TFAM을 측정하기 위한 공동염색 전략을 제공합니다. 미토콘드리아 부피 또는 질량의 측정을 통합함으로써, 이러한 프로토콜은 또한 미토콘드리아 단위 당 총 수준과 특정 수준의 측정을 허용합니다.
Protocol
참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 매체 및 솔루션의 레시피에 대해서는 재료 표 및 보충 표 S1 을 참조하십시오. 1. 인간 iPSC를 NCS, 도파민성(DA) 뉴런 및 성상세포로 분화 매트릭스 코팅 플레이트를 준비하십시오.매트릭스 5mL가 담긴 바이알을 얼음에서 밤새 해동합니다. 1mL의 매트릭스를 차가운 고급 Dulbecco의 변형 된 독수리 ?…
Representative Results
분화 방법 및 유세포 분석 전략에 대한 개략적인 설명이 그림 3에 나와 있습니다. 인간 iPSC는 신경 로제트로 분화된 다음 신경 영역으로 분화하기 위해 서스펜션 배양으로 들어 올려집니다. 신경 영역은 DA 뉴런으로 더욱 분화되고 성숙됩니다. 신경 구체는 단일 세포로 해리되어 신경교 성상 세포를 생성하고 NSC로 단층으로 재 도금 된 다음 성상 세포로 분화됩니다. 이 프로토…
Discussion
본원에는 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포를 생성하고 유세포분석을 사용하여 미토콘드리아 기능의 여러 측면을 평가하기 위한 프로토콜이 있습니다. 이러한 프로토콜을 통해 인간 iPSC를 뉴런과 신경교 성상 세포로 효율적으로 변환하고 대부분 살아있는 세포에서 미토콘드리아 기능을 자세히 특성화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 살아있는 세포의 부피, MMP 및 미토콘드리아 ROS 수준과 고정 세포?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
노르웨이 베르겐 대학교의 분자 이미징 센터와 유세포 분석 핵심 시설에 감사드립니다. 이 연구는 노르웨이 연구위원회 (보조금 번호 : 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat 및 중국 장학위원회 (프로젝트 번호 : 201906220275)의 자금으로 지원되었습니다.
Materials
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857, RRID:AB_445175 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-SSEA4 | Abcam | ab16287, RRID:AB_778073 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Sox2 | Abcam | ab97959, RRID:AB_2341193 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Pax6 | Abcam | ab5790, RRID:AB_305110 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Nestin | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927, RRID:AB_627994 | Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-GFAP | Abcam | ab4674, RRID:AB_304558 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-S100β conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab196442, RRID:AB_2722596 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; |
| anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Tuj 1 | Abcam | ab78078, RRID:AB_2256751 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Synaptophysin | Abcam | ab32127, RRID:AB_2286949 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-PSD-95 | Abcam | ab2723, RRID:AB_303248 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-NDUFB10 | Abcam | ab196019 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-SDHA | Abcam | ab137040 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-COX IV | Abcam | ab14744, RRID:AB_301443 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control. |
| Activin A | PeproTech | 120-14E | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| ABM Basal Medium | Lonza | CC-3187 | Basal medium for astrocyte culture |
| AGM SingleQuots Supplement Pack | Lonza | CC-4123 | Supplement for astrocyte culture |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | CDM ingredient |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Basal medium for dilute Geltrex |
| Bovine Serum Albumin | Europa Bioproducts | EQBAH62-1000 | Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | DA neurons medium ingredient |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer | BD Biosciences, USA | ||
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermo Fisher Scientific | 11905031 | CDM ingredient |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, Germany | ||
| Corning non-treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430589 | Suspension culture |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Used for a variety of cell culture wash |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565018 | Astrocyte differentiation basal Medium |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| Essential 8 Basal Medium | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | Basal medium for iPSC culture |
| Essential 8 Supplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Supplement for iPSC culture |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0314 | Supplement for NSC culture |
| FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Supplement for NSC culture |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12103C | Medium ingredient |
| FGF-basic | PeproTech | 100-18B | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| FCCP | Abcam | ab120081 | Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining |
| Fluid aspiration system BVC control | Vacuubrand, Germany | ||
| Formaldehyde (PFA) 16% | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Cell fixation |
| Geltrex | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Used for attachment and maintenance of human iPSCs |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Supplement for NSC culture |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | DA neurons medium ingredient |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Used for blocking buffer |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31765027 | Basal medium for CDM |
| Heregulin beta-1 human | Sigma-Aldrich | SRP3055 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain the nuclei for confocal image |
| Heracell 150i CO2 Incubators | Fisher Scientific, USA | ||
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21980032 | Basal medium for CDM |
| Insulin | Roche | 1376497 | CDM ingredient |
| InSolution AMPK Inhibitor | Sigma-Aldrich | 171261 | Neural induction medium ingredient |
| Insulin-like Growth Factor-I human | Sigma-Aldrich | I3769 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| KnockOut DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Basal medium for NSC culture |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | ||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | CDM ingredient |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | Used for mitochondrial volume indicator |
| MitoSox Red | Thermo Fisher Scientific | M36008 | Used for mitochondrial ROS indicator |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Neural induction medium ingredient |
| N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Used for blocking buffer |
| Orbital shakers – SSM1 | Stuart Equipment, UK | ||
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7405 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Purmorphamine | STEMCELL Technologies | 72204 | Promotes DA neuron differentiation |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting the coverslip for confocal image |
| PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Used for a variety of wash |
| Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein | R&D Systems | 423-F8-025/CF | Promotes DA neuron differentiation |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | TB1614-GMP | Neural Induction Medium ingredient |
| StemPro Neural Supplement | Thermo Fisher Scientific | A10508-01 | Supplement for NSCs culture |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Cell dissociation reagent |
| Transferrin | Roche | 652202 | CDM ingredient |
| TRITON X-100 | VWR International | 9002-93-1 | Used for cells permeabilization in immunostaining assays |
| TMRE | Abcam | ab113852 | Used for mitochondrial membrane potential staining |
| Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments | Grant Instruments, USA |
References
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Cite This Article
Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives. J. Vis. Exp. (177), e63116, doi:10.3791/63116 (2021).