JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63089
, , , , , , ,
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine,National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine,National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics,The Ohio State University

Summary

Een niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode om uracil-DNA glycosylase activiteit te testen werd ontwikkeld met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie voor directe apurine / apyrimidinische site-bevattende productanalyse. De test bleek vrij eenvoudig, specifiek, snel en gemakkelijk te gebruiken voor DNA-glycosylasemeting.

Abstract

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is een belangrijk onderdeel in de base excisie reparatie route voor de correctie van uracil gevormd door hydrolytische deaminering van cytosine. Het is dus cruciaal voor het behoud van de genoomintegriteit. Een zeer specifieke, niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode werd ontwikkeld om UDG-activiteit te meten. Een synthetische DNA-duplex met een site-specific uracil werd gesplitst door UDG en vervolgens onderworpen aan Matrix-assisted Laser Desorption / Ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analyse. Er werd een protocol opgesteld om het apurine/apyrimidinische site (AP) product in DNA te bewaren zonder strengbreuk. De verandering in de m/z-waarde van het substraat naar het product werd gebruikt om uracilhydrolyse door UDG te evalueren. Een G:U-substraat werd gebruikt voor UDG-kinetische analyse die de Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s en Kcat = 9,31 s-1 opleverde. Toepassing van deze methode op een uracilglycosylaseremmer (UGI)-test leverde een IC50-waarde van 7,6 pM op. De UDG-specificiteit met behulp van uracil op verschillende posities binnen enkelstrengs en dubbelstrengs DNA-substraten toonde verschillende splitsingsefficiënties. Deze eenvoudige, snelle en veelzijdige MALDI-TOF MS-methode zou dus een uitstekende referentiemethode kunnen zijn voor verschillende monofunctionele DNA-glycosylasen. Het heeft ook het potentieel als een hulpmiddel voor DNA-glycosylaseremmer screening.

Introduction

Hoewel uracil een normale base is in RNA, is het een veel voorkomende en zeer mutagene laesie in genomisch DNA. Uracil kan ontstaan door spontane/enzymatische hydrolytische deaminering van een deoxycytidine. In elke levende cel vindt deze deaminering 100-500 keer per dag plaats onder fysiologische omstandigheden1,2. Als deze veranderingen niet worden gerepareerd, kan er een verandering in de samenstelling van de DNA-sequentie optreden, waardoor mutatie ontstaat. Omdat uracil in DNA de voorkeur geeft aan paring met dATP tijdens replicatie, als cytosine deaminateert naar uracil, in twee replicatiegebeurtenissen, zal er een nieuwe G: C naar A: T overgangsmutatie zijn in de helft van het nageslacht DNA3.

Onder de cellulaire strategieën om de genetische stabiliteit te behouden, is base excision repair (BER) een essentieel mechanisme dat beschadigde basen, zoals uracil, in DNA4 herstelt. BER is een zeer evolutionair geconserveerd proces. Er zijn twee algemene BER-routes: de korte-patch pathway die leidt naar een reparatiekanaal van een enkel nucleotide en de long-patch pathway die een repair tract van ten minste twee nucleotiden produceert5. BER is een gecoördineerd mechanisme dat in verschillende stappen plaatsvindt. De eerste stap in BER is de enzymatische hydrolyse van de beschadigde nucleotidebasis door een schadespecifiek DNA-glycosylase om een apurine / apyrimidinische (AP) tussenliggende plaats te genereren6. Dit wordt gevolgd door de splitsing van de suiker-fosfaat ruggengraat op de AP-site door een endonuclease, opschoning van de DNA-uiteinden door een lyase, gap-vulling door een DNA-polymerase en het afdichten van de laatste nick door een ligase5.

Uracil-DNA glycosylase (UDG) hydrolyseert het uracil uit uracil-bevattend DNA voor BER in Escherichia coli. Conventionele UDG-testen met behulp van radioactief gelabeld DNA met verschillende scheidingstechnieken6,7,8,9,10,11,12,13 zijn meestal tijdrovend, arbeidsintensief, met dure etiketteringsreagentia, gecompliceerde procedures en vereisen intensieve training en oefening om de risico’s van blootstelling aan radioactieve materialen te verminderen. Fluorometrische oligonucleotide assays zijn ontwikkeld als vervanging voor radio-isotoop labeling14, naast moleculaire bakens en Förster resonantie energieoverdracht technologie15,16,17,18,19,20. Voor alle bovengenoemde methoden is echter specifieke etikettering vereist. Onlangs zijn labelvrije biosensoren getest21,22,23 en colorimetrische methoden op basis van de vorming van een G-quadruplex24,25,26. Meerdere A: U-paren of speciaal ontworpen sequenties in de sondes bemoeilijken echter de definitie van enzymeenheden.

MALDI-TOF MS is een technologie die van groot nut kan zijn bij DNA-analyse. Ontwikkelde toepassingen omvatten single-nucleotide polymorfisme genotypering27,28, gemodificeerde nucleotideanalyse29 en DNA-reparatie intermediaire identificatie30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS moet gemakkelijk worden gebruikt voor DNA-glycosylaseanalyse om AP-site-bevattende DNA-producten te detecteren. AP-sites in DNA zijn echter gevoelig voor strengbreuk onder veel experimentele omstandigheden33. Een UDG-test wordt hier gepresenteerd met behulp van MALDI-TOF MS om de productie van AP-locaties rechtstreeks te meten zonder significant strengbreukgeluid. Deze labelvrije methode is gemakkelijk om mee te werken en heeft een hoog potentieel voor de farmaceutische toepassing van DNA-glycosylaseremmerscreening.

Protocol

1. Voorbereiding van substraat/sjabloon Ontwerp uracil substraat/sjabloon duplex met een gebalanceerd G+C gehalte van ~50 ± 10% en minimale smelttemperatuur van 50 °C voor het duplexgebied.OPMERKING: Eén nucleotideverschil tussen 18 nt substraten en 19 nt sjablonen (tabel 1 en figuur 1) helpt een betere ms-signaalinterpretatie en de juiste gloeiing. De sjabloonstreng dient als aanvullend DNA om A-U- of G-U-mismatches te genereren (ta…

Representative Results

Sjablonen en substratenMet synthetische oligonucleotiden met U in het midden (U+9) in combinatie met een G-sjabloon als voorbeeld (figuur 1A), kan een blanco controle van equimolaire hoeveelheden sjabloon- en uracilbevattend substraat worden gebruikt voor kwaliteitscontrole van synthetische oligonucleotidezuiverheid (figuur 1B; de signalen komen overeen met de aangewezen m /z en de lage achtergrondruis). Voor de MS-data-analyse zijn de piekh…

Discussion

Dit artikel biedt een gedetailleerde procedure voor het gebruik van een UDG MALDI-TOF MS-testmethode om AP-bevattende DNA-producten direct te detecteren. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat uracil-bevattende substraten labelvrij, schaalbaar, gemakkelijk om mee te werken zijn en meer flexibiliteit bieden in substraatontwerp.

De door de leverancier aanbevolen fenol/chloroform-extractie van UDG maakt inactivatie van het enzym mogelijk om afbraak van product-DNA te voorkomen. Het …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken de NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) en het NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan, R.O.C. [subsidienummer MOST109-2314-B-002 -186 naar K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 naar S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 naar W.-h.F.]. H.-L.C. is een ontvanger van een doctoraatsbeurs van de National Taiwan University. Financiering voor open access charge: Ministerie van Wetenschap en Technologie, R.O.C.

Materials

2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. 生物化学. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. 生物化学. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O’Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. 生物化学. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Tags

Uracil-DNA GlycosylaseMALDI-TOF Mass SpectrometryDNA RepairAP ProductLabel-freeEnzyme Activity AssayGuanine-uracil BaseReaction BufferSubstrate PreparationReaction Termination

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chang, H., Su, K., Goodman, S. D., Cheng, W., Lin, L., Yang, Y., Chang, S., Fang, W. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image