Caenorhabditis elegans als een modelsysteem voor het ontdekken van bioactieve verbindingen tegen polyglutamine-gemedieerde neurotoxiciteit

OPMERKING: Zie tabel 1 voor de recepten van oplossingen die in dit protocol worden gebruikt. 1. Voorbereiding van materialen voor de Caenorhabditis elegans-test Onderhoud van C. elegans stammen Verkrijgen van C. elegans (AM141 en HA759) en Escherichia coli (OP50 en NA22) stammen (zie de tabel met materialen). Houd de aaltjes op de nematodengroeimedia (NGM) plaat gezaaid met E. coli OP50 op 20 °C voor AM14121 of 15 °C voor HA75923. Bereiding van E. coli OP50 bacteriekweek Kies een enkele kolonie E. coli OP50 uit een Luria-Bertani (LB) streepplaat en ent deze in tot 50 ml vloeibare LB-cultuur. Incubeer de OP50-bacteriën in een shaker bij 37 °C en 200 tpm tot een optische dichtheid van ~0,5 bij 570 nm (OD570). Bewaar de OP50 bacteriecultuur bij 4 °C en gebruik deze binnen twee weken. Bereiding van NGM-platen met OP50-bacteriën Voeg 20 g agar, 2,5 g pepton, 3,0 g NaCl en 975 ml gedeïoniseerd water toe aan een autoclaveerbare fles van 1 l. Autoclaaf bij 121 °C gedurende 30 min. Plaats de vloeibare NGM-agarfles op de bank om af te koelen tot ~ 60 ° C en voeg vervolgens de volgende steriele stamoplossingen toe: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg / ml cholesterol en 25 ml 1 M kaliumfosfaat (pH 6,0). Giet 20 ml NGM in een steriele petrischaal van 90 mm en laat de borden op de bank liggen om af te koelen en te stollen. Houd de borden ondersteboven en laat ze 2 dagen op kamertemperatuur op de bank drogen. Doseer 200 μL van de OP50 bacteriecultuur op elke NGM-plaat en verdeel gelijkmatig met een steriele glazen coatingstaaf. Sluit de deksels en incubeer de platen een nacht bij 37 °C. Bewaar de met OP50 bezaaide NGM-platen in een plastic doos met deksel bij kamertemperatuur en gebruik binnen twee weken. Voorbereiding van leeftijdsgesynchroniseerde C. elegans populatie Verzamel gravid volwassen nematoden in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 1 minuut op 1000 × g . Was drie keer en resuspenseer de aaltjes in M9 buffer. Voeg een gelijk volume bleekoplossing toe en roer voorzichtig gedurende 3-5 minuten. Controleer het bleken om de 15 s onder een ontleedmicroscoop.OPMERKING: De bleekoplossing moet vóór gebruik vers worden bereid door gelijke volumes van 10% NaOCl en 1 M NaOH te mengen (tabel 1)20. Zodra de meeste nematoden zijn afgebroken, stopt u de spijsvertering door te verdunnen met M9-buffer. Centrifugeer snel om het supernatant te verwijderen en resuspenseer de pellet in M9-buffer om het wassen drie keer te herhalen. Resuspendeer de pellet in S medium. Laat de nematodenresten 2-3 minuten door de zwaartekracht bezinken terwijl de eieren in het supernatant blijven. Giet het supernatant op in een nieuwe steriele microcentrifugebuis. Verzamel de eieren door centrifugeren op 1000 × g gedurende 1 min. Gooi ~ 80% van het supernatant weg en breng de eieren over in een steriele kolf met 20 ml S-medium. Plaats de kolf in een shaker en broed de eieren een nacht zonder voedsel bij 120 rpm uit om gesynchroniseerde L1-nematoden te verkrijgen. 2. PolyQ-aggregatietest Voorbereiding van nematoden voor de polyQ-aggregatietest Breng 300-500 gesynchroniseerde L1-larven van AM141 over naar elke put van een 48-well plaat met 500 μL S-medium met OP50 (OD570 van 0,7-0,8) en 5 mg / ml astragalan, meestal één put per behandeling gedurende één tijdstip. Sluit de plaat af met parafilm en incubeer bij 20 °C en 120 tpm gedurende 24, 48, 72 en 96 uur. Oogst de aaltjes in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en was met M9-buffer >3 keer door centrifugatie (1000 × g gedurende 1 minuut) om de resterende OP50 te verwijderen. Resuspendeer de AM141-nematoden in M9-buffer en houd ze klaar voor beeldacquisitie. Acquisitie van fluorescerende beelden en data-analyseOPMERKING: Gegevens worden automatisch geanalyseerd met dit high-content imaging-systeem. Als er geen geautomatiseerd beeldvormingsapparaat beschikbaar is, kan een conventionele methode om een agarosepad voor beeldacquisitie voor te bereiden worden gebruikt om vergelijkbare prestaties te bereiken met behulp van een gemeenschappelijke fluorescerende microscoop 7,15,17 (zie stappen 3.2 en 3.3). Breng 10-15 nematoden over in elke put in een plaat met 384 putten (eindvolume 80 μL per put). Stel 10 repliceerputten in voor elke behandeling. Voeg 10 μL 200 mM natriumazide toe aan elke put om de nematoden te verlammen en laat ze naar de bodem zakken (5-10 min). Plaats de plaat in een beeldverwerkingssysteem met een hoog gehalte om fluorescerende beelden te verkrijgen (zie de materiaaltabel voor informatie over apparaten en software). Open de software voor het verkrijgen van afbeeldingen en stel de volgende parameters in. Open het venster Plate Acquisition Setup en maak een nieuwe experimentset en -naam. Selecteer Vergroting als 2x, Camera binning als 1 en Plaattype als 384-well plaat. Stel de putten en sites (enkele site) in die moeten worden bezocht. Selecteer het filter fluoresceïneisothiocyanaat (FITC) en schakel beeldgebaseerde scherpstelopties in. Stel de belichting in op 300 ms.OPMERKING: De bovenstaande instellingen kunnen worden getest en aangepast om de beeldparameters te optimaliseren. Sla de instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen op en klik op de knop Plaat verwerven om uit te voeren. Analyseer de beeldgegevens met behulp van de beeldanalysesoftware. Open het venster Testplaatgegevens en selecteer de testplaat voor beeldanalyse. Dubbelklik op een testvak om de afbeelding weer te geven. Selecteer de Count Nuclei als de analysemethode en klik op de knop Instellingen configureren om een venster te openen voor de volgende instellingen. Definieer de bronafbeelding van het FITC-kanaal en selecteer het standaardalgoritme. Stel de parameters voor de beeldanalyse als volgt in: geschatte minimumbreedte = 10 μm (= 2 pixels); geschatte maximale breedte = 50 μm (= 12 pixels); intensiteit boven lokale achtergrond = 1.000-2.000 grijsniveaus. Test de huidige instellingen om de analysemethode te optimaliseren. Sla de instellingen op en voer de analyse uit op alle putten.OPMERKING: Het duurt ~ 20 minuten om de analyse voor één 384-well plaat te voltooien. Exporteer de Total Nuclei als het totale aantal Q40::YFP-aggregaten in elke put. Tel het aantal aaltjes in elke put. Bereken het gemiddelde aantal Q40::YFP-aggregaten per nematode in elke groep en pas een niet-lineaire curve toe die past bij de gegevens vanaf elk tijdstip. Bereken de remmingsindex met behulp van eq (1) hieronder:Remmingsindex = (1)WaarbijN-controle enN-monster het gemiddelde aantal Q40::YFP-aggregaten in respectievelijk de controlegroep en de behandelingsgroep zijn. 3. PolyQ-gemedieerde neurotoxiciteitstests Behandeling van C. elegans met testmonsters Om nematoden voor te bereiden op de polyQ neurotoxiciteitstest, breng 300-500 gesynchroniseerde L1-larven van HA759 over naar elke put van een 48-well plaat met 500 μL S-medium met OP50 (OD570 van 0,7-0,8) en 5 mg / ml astragalan, meestal drie repliceerputten voor elke behandeling. Sluit de plaat af met parafilm en incubeer bij 15 °C en 120 tpm gedurende 3 dagen23. Verzamel de aaltjes door centrifugeren en was 3-5 keer met M9 buffer. Resuspendeer de nematoden in M9-buffer voor gebruik in neuronale overlevings- en vermijdingstests. Bereiding van agarose pad Voeg 2 g agarose toe aan 100 ml M9-buffer (2%, w/v) en verwarm de agarose-oplossing in een magnetron tot bijna-kokend. Doseer 0,5 ml gesmolten agarose op het midden van een 1 mm dikke microscopieglasplaat geplaatst tussen twee stukken van 2 mm dikke glasplaten. Dek af met een andere schuif verticaal. Zodra de agarose is afgekoeld en gestold, verwijdert u voorzichtig de bovenste schuif. ASH neuronale overlevingstest Voeg een druppel van 20 mM natriumazide toe aan de agarose pad. Breng 15-20 HA759-nematoden over in de druppel om ze te immobiliseren. Leg voorzichtig een deklip over de aaltjes. Bewaar de dia onder een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een digitale camera. Selecteer een 40x objectief lens en FITC filter om GFP-positieve ASH neuronen in het hoofdgebied van de nematoden te detecteren. Selecteer willekeurig meer dan 50 nematoden in elke groep om het aantal nematoden te tellen met GFP-gelabelde bilaterale ASH-neuronen in hun hoofdgebied7. Bereken de overlevingskans van ASH-neuronen met behulp van eq (2) hieronder.Neuronale overleving (%) = (2)WaarbijN-overleving enN-totaal respectievelijk het aantal nematoden met GFP-positieve ASH-neuronen en het totale aantal geteste nematoden in elke groep zijn. Osmotische vermijdingstest Verdeel een voedselvrije NGM-plaat (9 cm) in normale (N) en val (T) zones door een 8 M glycerol (~ 30 μL) lijn in het midden. Verdeel een 200 mM natriumazide (~ 20 μL) lijn op ~ 1 cm afstand van de glycerollijn om de nematoden die door de glycerolbarrière naar Zone T gaan te verlammen. Breng ~ 200 nematoden elk over op Zone N van drie replicaatplaten voor elke groep. Voeg een druppel van 1% butanedion (~2 μL) toe aan Zone T (1 cm van de plaatrand) om de aaltjes aan te trekken. Dek het deksel van de petrischaal onmiddellijk af en incubeer gedurende 90 minuten bij 23 °C. Scoor het aantal aaltjes op de N- en T-zones onder een microscoop. Bereken de vermijdingsindex met behulp van eq (3)20.Vermijdingsindex = (3)Waarbij N en T het aantal aaltjes in respectievelijk N- en T-zones zijn. Gegevens worden gepresenteerd als middel ± standaarddeviatie (SD) van drie replicaties, representatief voor >3 onafhankelijke experimenten. Voer een ongepaarde, tweezijdige t-test uit om de gegevens van de astragalan- en controlegroepen te vergelijken. 4. Een radarkaart maken Open de grafische software en importeer gegevens van verschillende testen in een nieuw blad. Voer de kolom A(X) in als de titels van de radiale assen, de kolom A(Y) als de gegevens van de controlegroep en de kolom B(Y) als de gegevens van de behandelingsgroep. Selecteer de gewenste gegevens en klik op Plot | Gespecialiseerd: Radarknop in het werkbalkmenu om een radardiagram te genereren. Dubbelklik op de radiale as en pas de labels Schaal, Vink en Vink van elke as zo nodig aan. Klik op Bestand in het menu en selecteer Grafieken exporteren om de afbeelding op te slaan als *.tiff.OPMERKING: De softwarewebsites in de materiaaltabel bieden gedetailleerde helpdocumenten en videozelfstudies voor het maken van radardiagrammen.