Imagerie en direct de l’état redox du glutathion mitochondrial dans les neurones primaires à l’aide d’un indicateur ratiométrique

Plusieurs enzymes mitochondriales et molécules de signalisation importantes sont soumises à la régulation redox ^thiol1. De plus, les mitochondries sont une source cellulaire majeure d’espèces réactives de l’oxygène et sont sélectivement vulnérables aux dommages oxydatifs2. En conséquence, le potentiel redox mitochondrial affecte directement la bioénergétique, la signalisation cellulaire, la fonction mitochondriale et, en fin de compte, la viabilité ^{cellulaire3,4}. La matrice mitochondriale contient de grandes quantités (1-15 mM) de glutathion tampon redox thiol-disulfure (GSH) pour maintenir l’homéostasie redox et monter des défenses ^{antioxydantes5,6}. Le GSH peut être attaché de manière covalente aux protéines cibles (S-glutathionylation) pour contrôler leur statut et leur activité redox et est utilisé par une gamme d’enzymes détoxifiantes qui réduisent les protéines oxydées. Par conséquent, le potentiel redox du glutathion mitochondrial est un paramètre très informatif lors de l’étude de la fonction mitochondriale et de la physiopathologie.

roGFP2 est une variante de GFP qui a été rendue redox-sensible par l’ajout de deux cystéines exposées à la surface qui forment une paire artificielle dithiol-disulfure7,8. Il a un seul pic d’émission à ~510 nm et deux pics d’excitation à ~400 nm et 490 nm. Il est important de noter que les amplitudes relatives des deux pics d’excitation dépendent de l’état redox de roGFP2 (Figure 1), ce qui fait de cette protéine un capteur ratiométrique. Dans le capteur Grx1-roGFP2, la glutarédoxine-1 humaine (Grx1) a été fusionnée à la terminaison N de roGFP29,10. La fixation covalente de l’enzyme Grx1 à roGFP2 offre deux améliorations majeures du capteur : elle rend la réponse du capteur spécifique pour la paire redox GSH/GSSG glutathion (Figure 1), et elle accélère l’équilibrage entre GSSG et roGFP2 d’un facteur d’au moins 100 0009. Par conséquent, Grx1-roGFP2 permet une imagerie spécifique et dynamique du potentiel redox cellulaire du glutathion.

L’imagerie Grx1-roGFP2 peut être réalisée sur une large gamme de microscopes, y compris les microscopes à fluorescence à grand champ, les microscopes confocaux à disque rotatif et les microscopes confocaux à balayage laser. L’expression du capteur dans les neurones primaires peut être obtenue par diverses méthodes, notamment la ^{lipofection11}, la coprécipitation ADN/calcium-phosphate12, le transfert de gènes médié par le virus ou l’utilisation d’animaux transgéniques comme source cellulaire (Figure 2). Des virus adéno-associés recombinants pseudotypés (rAAV) contenant un rapport de 1:1 de protéines de capside AAV1 et AAV2 ^13,14 ont été utilisés pour les expériences de cet article. Avec ce vecteur, l’expression maximale du capteur est généralement atteinte 4 à 5 jours après l’infection et reste stable pendant au moins deux semaines. Nous avons utilisé avec succès Grx1-roGFP2 dans les neurones primaires de l’hippocampe et du cortical de souris et de rats.

Dans cet article, l’expression médiée par le rAAV de Grx1-roGFP2 ciblé par les mitochondries dans les neurones hippocampiques et corticaux primaires du rat est utilisée pour évaluer l’état redox du glutathion mitochondrial basal et sa perturbation aiguë. Un protocole est fourni pour l’imagerie confocale en direct avec des instructions détaillées sur la façon (i) d’optimiser les paramètres du microscope confocal à balayage laser, (ii) d’exécuter une expérience d’imagerie en direct et (iii) d’analyser les données avec FIJI.