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神经科学

Dissecção crio-seção da zona subependímal adulta para análise proteome quantitativa precisa e profunda

Published: October 07, 2021
doi:
10.3791/63047
, ,
1Division of Physiological Genomics, Biomedical Center,Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for Stem Cell Research,Helmholtz Zentrum München, 3SYNERGY, Excellence Cluster Systems Neurology,University of Munich, 4Department of Clinical Neuroscience,Karolinska Institutet

Summary

A dissecção crio-seção permite a preparação fresca e congelada do maior nicho neurogênico do cérebro murino para análise profunda de proteome quantitativo. O método é preciso, eficiente e causa perturbação mínima do tecido. Portanto, é ideal para estudar o microambiente molecular desse nicho, bem como outros órgãos, regiões e espécies.

Abstract

O nicho neurogênico subependímico consiste em uma fita paraventricular da parede ventricular lateral do ventrículo lateral. A zona subependímal (SEZ) é uma região fina e distinta exposta aos ventrículos e fluido cefalorraquidiano. O isolamento desse nicho permite a análise de um microambiente neurogênico de células-tronco. No entanto, a extração de pequenos tecidos para análise proteome é desafiadora, especialmente para a manutenção de uma profundidade de medição considerável e a obtenção de robustez confiável. Um novo método denominado crio-seção-dissecção (CSD), combinando alta precisão com perturbação mínima do tecido, foi desenvolvido para enfrentar esses desafios. O método é compatível com métodos de espectrometria de massa (MS) de última geração que permitem a detecção de reguladores de nicho de baixa abundância. Este estudo comparou o CSD e seus dados proteomes ao método e dados obtidos por microdisseção de captura a laser (LCM) e uma dissecção de integralidade padrão. O método CSD resultou em duas vezes a profundidade de quantificação em menos da metade do tempo de preparação em comparação com o LCM e, simultaneamente, superou claramente a precisão de dissecção de toda a dissecção. Assim, o CSD é um método superior para a coleta do SEZ para análise proteome.

Introduction

Como a neurogênese é restrita no cérebro adulto, várias estratégias de reparação do sistema nervoso central se beneficiariam muito de uma compreensão aumentada dos fundamentos da substituição neural adulta. Roedores nos ajudaram a entender os mecanismos básicos da neurogênese pós-natal, embora deva ser notado que a neurogênese adulta é muito dependente de espécies. Em camundongos, existem três nichos de células-tronco neurais adultas (NSC). O hipotálamo é um nicho de NSC adulto com potencial neurogênico1,2, enquanto a neurogênese adulta contínua é restrita principalmente ao hipocampo3 e ao SEZ das paredes laterais dos ventrículos laterais4,5,6. O SEZ é a maior região germinal contendo NSCs (células tipo B) que se desenvolvem em neuroblastos (células tipo A) através de células progenitoras amplificadoras de trânsito (células tipo C). O SEZ contém 20-35% das células tipo B, 1-15% das células tipo C, 1-30% das células tipo A e 25-50% das células ependímicas7. O SEZ possui uma microarquitetura complexa, com células endoteliais, células microgliais e células ependímicas que residem e influenciam o nicho de células-tronco8,9,10. Embora os neurônios sejam escassos no SEZ, os axônios emanando de fontes distantes, como o estriado, a área tegmental ventral, ou o hipotálamo alcançar e influenciar células tipo B4. Uma característica única desse nicho de células-tronco é a separação entre o local de proliferação e o local de diferenciação. Após a proliferação, os progenitores neuronais migram vários milímetros do SEZ para a lâmpada olfativa, onde se diferenciam terminalmente em neurônios e se integram a circuitos neurais pré-existentes. As investigações sobre programas intrínsecos associados à neurogênese já forneceram conhecimento importante para estratégias experimentais de reprogramação e transplante celular 15,16,17,18,19,20. No entanto, sinais extrínsecos de células também regulam a neurogênese, e ambientes teciduais podem determinar o destino neurogênico das células-tronco11,12,14,21,22,23. Consequentemente, a investigação do microambiente dos nichos neurogênicos e sua interação com as células-tronco é de fundamental importância.

A matriz extracelular (ECM) e outras proteínas secretadas são uma grande parte do microambiente. Para identificação e quantificação precisas, uma abordagem proteômica é mais adequada do que uma abordagem transcriômica para determinar a composição do ECM devido à baixa correlação entre os níveis de transcriptome e proteína para ECM24,25. Além disso, há evidências substanciais de que os reguladores de nicho no SEZ não são produzidos exclusivamente por células que povoam o nicho em si. Locais mais distantes, como o plexo coroide, secretam sinais modulatórios transmitidos às células-tronco através do fluido cefalorraquidiano22,23. Investigar o nicho proteome pode ajudar a identificar os reguladores de nicho presentes no nicho independente de seu local de produção, uma vez que uma proporção substancial do microambiente extracelular é montada por proteínas.

Para coletar a zona ventricular murina para análise proteômica imparcial, é necessário um método com alta precisão, capturando a fita paraventricular fina de cerca de 50 μm contendo células-tronco, excluindo o tecido do estriado adjacente. Além disso, a perturbação tecidual durante a dissecção deve ser minimizada para analisar o microambiente extracelular, pois proteínas solúveis, incluindo fatores de crescimento ou citocinas, poderiam ser lavadas facilmente. Embora seja possível analisar os espectros de massa do tecido fixo, o agente necessário, como o paraformaldeído, reduzirá a profundidade de identificação da proteína e poderá introduzir modificações pós-transicionais. Uma dissecção de sez integral comum, por exemplo, para a coleta de células para análise de triagem celular ativada por fluorescência, remove toda a SEZ com tesoura26. Esta dissecção padrão é rápida com perturbação mínima do tecido. No entanto, a contaminação estriatal das amostras não pode ser evitada. Por outro lado, o LCM tem a excelente vantagem da precisão de dissecção superior. No entanto, o LCM pode introduzir perturbações teciduais, por exemplo, devido à coloração de fundo ou desnaturação de proteínas causadas pelo laser. Para combinar os pontos fortes da dissecção total e LCM, foi desenvolvido um novo método compatível com a EM, denominada crio-seção-dissecção (CSD). O CSD permite a extração do SEZ e a dissecção do SEZ das paredes mediais dos ventrículos laterais (MEZ), que é uma região ideal, principalmente de controle não neurogênico para o SEZ (ver o protocolo). O nicho de proteome obtido pela combinação de métodos de DSC e ms de última geração mostrou-se útil para a caracterização e identificação de novos reguladores neste nicho de NSC adulto25. Assim, este método será útil para a determinação da composição da proteína tecidual SEZ.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais deste estudo foram realizados de acordo com as diretrizes alemãs e da União Europeia e foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados com animais e pelo governo da Alta Baviera (Regierung von Oberbayern). Apenas camundongos C57Bl6 machos entre 8 e 10 semanas foram usados para os experimentos. 1. Preparação do cérebro do camundongo (~ 15 min por mouse) Prepare o meio de dissecção adicionando 5 mL de 1 M HEPES (concentração final de 10 mM) a 500 mL de 1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS).NOTA: O tempo de armazenamento do meio de dissecção (+4 °C) não deve exceder 2 semanas. Sacrifique os ratos por luxação cervical e disseca cuidadosamente o cérebro.NOTA: Ao investigar o ECM, o tecido deve ser preferencialmente não modificado. A luxação cervical mantém o tempo de dissecção o mais curto possível, evitando assim a autodigestão enzimática pós-mortal o máximo possível. Se a remoção de sangue é fundamental para a questão da pesquisa, basta perfumar o rato transcardialmente com soro fisco tamponado (PBS) antes de remover o cérebro. Extrair o cérebro por dissecção manual e colocá-lo em um prato de cultura contendo meio de dissecção gelada (Figura 1B – 1).NOTA: Mantenha os cérebros em meio de dissecção no gelo durante toda a dissecção. Remova a lâmpada olfativa (OB) com um bisturi (Figura 1B – 2) por um corte coronal reto entre o OB e o polo anterior do córtex. Remova o polo anterior do córtex com o bisturi usando um corte coronal para tornar os ventrículos laterais visíveis no plano coronal (Figura 1B – 3).NOTA: Certifique-se de que o corte coronal seja feito ~5 mm rostrally do quiasmo óptico; caso contrário, a parte rostral do SEZ/MEZ será perdida. Usando tesoura, abra os dois ventrículos laterais do topo, começando com uma seção sagital da superfície cortical até o lúmen ventricular, e alongue este corte de forma c após a flexão ventricular (Figura 1B – 4). Conecte as extremidades caudal da incisão sagital esquerda e direita por meio de um corte coronal adicional com a tesoura.NOTA: Os três cortes agora formam um trapézio e facilitarão a remoção do córtex e do corpus calosum na próxima etapa. Remova o córtex e o caloso corpus que cobrem os ventrículos laterais usando fórceps (Figura 1B – 5). Em seguida, remova o córtex e o calosum corpus que cobrem as paredes ventriculares medial. Aqui, faça cortes adicionais se o tecido estiver preso às paredes ventriculares medial, ou simplesmente levantar o córtex e o caloso corpus com uma tesoura para desalojar o tecido. Espalhe cuidadosamente as paredes ventriculares com fórceps (Figura 1B – 6). Remova o plexo coroide com fórceps.NOTA: A remoção completa do plexo coroide é importante para evitar interferências nas seguintes etapas de dissecção e evitar a contaminação potencial das amostras de SEZ/MEZ. Coloque o cérebro em uma lâmina de vidro e coloque o deslizamento de vidro em cima de gelo seco para congelar o cérebro. Mantenha as paredes ventriculares na configuração aberta.NOTA: Certifique-se de distância suficiente entre as paredes laterais e medial do ventrículo para facilitar a dissecação precisa e exclusiva de SEZ e MEZ. Se o tecido contrair de volta em uma configuração fechada, use os fórceps para fixar as paredes na posição desejada durante o congelamento. Evite danos ao SEZ/MEZ. Tente aplicar força mínima, principalmente na borda superior dos ventrículos abertos. 2. Secção do cérebro preparado (~ 15 min por mouse) Corte seções coronais de 50-100 μm de espessura do cérebro até o final do ventrículo lateral usando um criostat e monte as seções em lâminas de vidro. Certifique-se de que o cérebro está preso à placa de fixação criostat no cérebro traseiro com meio OCT e que nenhuma OCT entra em contato com o cérebro, especialmente nos ventrículos.NOTA: O meio OCT interferirá nas medições de MS. No entanto, se o tecido será usado para um ensaio de anticorpos, é desnecessário excluir o meio OCT. O uso de lâminas de vidro revestidas não é recomendado. Lâminas revestidas aplicam muita força adesiva no tecido, impedindo assim a translocação da amostra de tecido das lâminas para o tubo de microcentrifuuge nas etapas seguintes. 3. Dissecção à mão livre de fatias cerebrais (~ 30 min por mouse) Coloque as lâminas de vidro com as seções cerebrais em gelo seco sob um microscópio de dissecção (Figura 1C – 1). Prepare os tubos de microcentrifuuagem em gelo seco e certifique-se de que os tubos permaneçam em gelo seco por pelo menos 1 minuto para serem suficientemente frios antes da transferência da amostra.NOTA: Use tubos de microcentrifuuge de alta qualidade, pois alguns tubos de baixa qualidade podem derramar plástico nas etapas subsequentes de digestão tecidual associadas às medidas de ESM. Levante as fatias do gelo seco por 15-30 s para obter um descongelamento breve e incompleto para tornar a mielina compacta do estria observável como pontos brancos densos.NOTA: A localização da fronteira entre o SEZ e o estriato torna-se viável (Figura 1C – 2, ver Figura 2A para a exclusão da mielina e uma comparação com o método de toda a quantidade). Se o descongelamento demorar muito, o processo pode ser acelerado pressionando um dedo coberto de luva no lado oposto do deslizamento de vidro. No entanto, essa manobra deve ser praticada, pois o descongelamento excessivo ocorre facilmente. Separe o SEZ com um bisturi pré-cozido do estriado adjacente (Figura 1C,D). Transfira o SEZ como uma peça inteira ou seccionado em 2-4 partes em um tubo de microcentrifuuge usando a borda cega do bisturi resfriado. Se o tecido for usado para outro tipo de análise que não a ESM, transfira a amostra de tecido para o recipiente apropriado (por exemplo, uma placa de 96 poços).NOTA: Cortar o tecido completamente congelado pode levar ao tecido que se rompe rapidamente e cai da lâmina. Cortar tecido completamente descongelado leva à desintegração do tecido. Certifique-se de que o tecido não está completamente congelado nem completamente descongelado.

Representative Results

Ao seguir as etapas acima, as amostras de tecido nos tubos de microcentrifuuge estão prontas e compatíveis com a preparação da amostra de MS. Após a preparação da amostra, obtivemos ~5-7 μg de peptídeos por amostra de SEZ ou MEZ por rato. No entanto, os valores finais dos peptídeos podem depender do método de preparação de MS. Nas comparações proteome abaixo, a identificação de proteínas e a profundidade de quantificação (500-1.000 proteínas por amostra) foram aumentadas por correspondência computacional do espectro de peptídeos com bibliotecas de espectros de peptídeos criadas para cada região tecidual25,27. Notavelmente, o método de fracionamento nano sem perdas usado aqui para a criação das bibliotecas de espectros de peptídeos não está atualmente disponível comercialmente. Os dados brutos de MS foram analisados utilizando o software MaxQuant28, alcançando precisãos de massa nas partes por bilhão de faixa29. O ambiente Max Quant permite a correspondência entre as corridas de MS. A abundância de proteínas foi quantificada usando um algoritmo de quantificação sem rótulo30. A coloração imunohistoquímica foi feita em tecidos congelados frescos e realizada como relatado anteriormente25 (ver a Tabela de Materiais). Dissecção de seção criobidaOs SEZ completos e MEZ de camundongos adultos (n = 4) foram obtidos utilizando CSD (ver Figura 1 e protocolo). O córtex somatosensorial (Cx) foi dissecado com tesoura cirúrgica. Outros 4 camundongos foram dissecados da mesma forma; no entanto, o tecido dissecado foi agrupado em uma amostra por região para criar a biblioteca proteome (10.923 proteínas identificadas) para maior identificação e quantificação de proteínas nas amostras individuais25. Nas quatro amostras individuais, (média ± SD) 6.673 ± 317,4 proteínas foram quantificadas no SEZ e 6.747 ± 37,7 no MEZ. Todos os dados de proteômica de MS foram depositados no Consórcio ProteomeXchange através do repositório de parceiros PRIDE31 , e o número de adesão para os proteomes relatados aqui é ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org). Comparação com dissecção de integralA dissecção integral foi realizada de acordo com um protocolo padrão26. A dissecção total revelou um número semelhante de proteínas (aproximadamente 6.000 para SEZ e 6.000 para Cx, n = 4 por grupo) em comparação com CSD25. Uma das melhorias pretendidas do uso do DSC para o SEZ, em vez de um protocolo de dissecção integral, é a redução da contaminação estrital potencial. Em amostras de SEZ contaminadas com tecido de outra região, proteínas candidatas detectadas não podem ser alocadas para uma região, pois o enriquecimento significativo pode resultar da região de interesse e do contaminador. Imunohistoquesticamente, as cápsulas internas ricas em mielina (MAG) positivas do estriado foram identificadas em amostras de toda a quantidade, mas raramente nas amostras de CSD (Figura 2A). A contaminação estriatal em amostras de todo o montante pode ser confirmada identificando o enriquecimento de proteínas de mielina no SEZ em comparação com as amostras do córtex somatosensorial (Cx) Grey Matter (GM) (Figura 2B). Observe que grandes partes do Cx GM, especialmente as camadas Cx superiores, não sãoomiadas32. À medida que grandes feixes de fibras passam pelo estriato, a contaminação por essa região resultou no enriquecimento das proteínas da mielina em comparação com o Cx. As proteínas de mielina utilizadas como marcadores para contaminação estriatal nas amostras de SEZ foram a proteína básica de mielina (MBP), a glicoproteína associada à mielina (MAG), a proteína proteolipid 1 (Plp1) e a 2′,3′-cíclica-nucleotídeo 3′-fosfodiesterase (Cnp). Todas as proteínas marcadoras de mielina foram significativamente enriquecidas no SEZ em comparação com o Cx. Por outro lado, as comparações para as quatro proteínas marcadores de mielina no conjunto de dados do CSD não produziram diferenças significativas quando comparadas à SEZ com cx (Figura 2B). Os dados proteômicos do estriatum33 sustentam a hipótese de que o enriquecimento das proteínas da mielina nas amostras de SEZ de toda a dissecção foi causado pela contaminação com tecido estriado. Assim, o CSD impediu em grande parte a contaminação pelo tecido estriatal (rico em mielina compacta) em comparação com uma dissecção de toda a quantidade. A análise de proteome imparcial do tecido não dissociado pode revelar proteínas extracelulares interessantes. Com a dissecção melhorada utilizando o CSD, as proteínas extracelulares foram significativamente enriquecidas nas amostras em comparação com as amostras de toda a quantidade (Figura 2C, teste de enriquecimento de anotações). O CSD e a dissecção integral exibem um enriquecimento comparável dos termos de ontologia genética (GO) “exososome vesicular extracelular” e “parte da região extracelular”. No entanto, o termo GO “Matrisome-associated” é ligeiramente mais enriquecido no CSD do que em toda a dissecção de valores. Assim, a enzima de ligação cruzada ECM e a transglutaminase-2 (Tgm2) foram encontradas enriquecidas no SEZ em comparação com cx usando o CSD25. Em contrapartida, não foi encontrada diferença entre amostras de SEZ e Cx obtidas pela dissecção integral (Figura 2D). Dados proteômicos do estriatum33 sustentam a hipótese de que a detecção do regulador de neurogênese Tgm2 por dissecção integral foi impedida pela contaminação com tecido estriostal. Assim, no geral, a dissecção crio-seção é uma melhoria bem sucedida, mas também necessária para a dissecção padrão para análise proteome específica do nicho. Comparação com microscopia de captura a laserA metade dianteira do SEZ e o MEZ de 3 camundongos adultos foram obtidos para LCM (Figura 3A ). No geral, o método LCM apresenta algumas desvantagens, especificamente no que diz respeito à perturbação e eficiência tecidual. Para visualizar a região de interesse sob o microscópio de dissecção, é necessário coloração de fundo, potencialmente lavando pequenas ou solúveis proteínas de interesse, por exemplo, fatores de crescimento, citocinas ou reguladores de ECM, como enzimas. Além disso, os slides passam tempos variados à temperatura ambiente durante a remoção do laser. Além disso, o laser em si pode desnaturar proteínas de interesse. O CSD tem uma vantagem considerável sobre o LCM em relação ao tempo e esforço necessários para realizar a dissecção: a etapa 1 do protocolo deve ser realizada de forma semelhante tanto para CSD quanto para LCM; sem essa etapa, as paredes ventriculares permanecem aderentes, dificultando a separação das amostras de MEZ e SEZ. Dado que as seções de CSD (100 μm) são 6-7 vezes mais grossas que a espessura máxima34 das seções LCM (15 μm), passo 2 (seção do cérebro) e passo 3 (remover o MEZ e SEZ de cada seção coronal) levará pelo menos 6-7 vezes mais tempo para LCM. A coloração de fundo necessária e a configuração do microscópio laser consumirão tempo adicional. Aqui, demorou três vezes mais para colher 50% do SEZ e MEZ de 3 animais por LCM em comparação com 100% do SEZ e MEZ de 4 animais por CSD, constituindo uma vantagem de oito velocidades de CSD. Em resumo, o LCM não só requer uma quantidade notável de esforço adicional, mas o tecido também é submetido a um período substancialmente mais longo de manipulação e mudanças de temperatura que podem comprometer a dinâmica e a confiabilidade dos dados gerados pela análise subsequente. Os resultados de DSM foram comparados com os resultados da microdisseção de captura a laser (LCM). Ambos os conjuntos de dados foram combinados com a biblioteca proteômica gerada pela junção de amostras de CSD. Em média, a LCM rendeu 3.441 ± 270,0 e 3.613 ± 238,7 proteínas individuais no SEZ e na zona ventricular medial, respectivamente (Figura 3B). Dada a notável diferença na identificação da proteína, a análise dos componentes principais (PCA) apresentou separação distinta de acordo com o método de dissecção (componente 1: 62,7%, não mostrado). O componente 2 apresentou a maior separação para SEZ e MEZ entre as amostras de LCM (8,5%, Figura 3C). O componente 3 também parece separar LCM e CSD; no entanto, essa diferença pode resultar de diferenças baseadas em métodos em vez do número de proteínas identificadas (6,4%). No entanto, a separação regional global permaneceu notavelmente distinta para os dados de dissecção crio-dissecção e muito melhor do que para o LCM. Essa discrepância na dinâmica dos dados pode resultar de diferentes tempos gastos pelos espécimes à temperatura ambiente durante a dissecção a laser ou uma maior suscetibilidade de pequenas quantidades de tecido à variabilidade nos protocolos subsequentes de proteômica e medições de espectrometria de massa. Para buscar diferenças no perfil proteome do ECM, foi realizado um teste de enriquecimento de anotação 2D entre CSD e LCM para o SEZ e MEZ (Figura 3D). O cálculo do enriquecimento relativo dos termos GO entre as amostras de LCM e CSD permite a comparação da dinâmica proteome relativa dos aglomerados proteicos ECM entre os dois métodos, apesar da quantidade desigual de tecido e das diferenças no protocolo de dissecção. As tramas revelam uma boa correlação entre LCM e CSD. As anotações “parte extracelular da região” e “organela extracelular ligada à membrana” são igualmente enriquecidas em métodos e regiões. Assim, o aumento da demanda de tempo de LCM não parece ser compensado por uma sensibilidade relativamente maior para proteínas associadas ao ECM. Em vez disso, o CSD fornece identificação/quantificação mais robusta ao comparar os dados amostrais para as proteínas ECM associadas à neurogm2, Trombospondina-4 (Thbs4), S100a6 e Tenacin-C (Tnc) (Figura 3E). No caso do TnC, embora quantificado em todas as amostras, apenas o CSD apresentou enriquecimento para o SEZ em comparação com o MEZ. No entanto, as proteínas de membrana basal associada ao SEZ Nidogen-1 (Nid1), laminin subunnit beta-2 (Lamb2) e a proteína do núcleo protelícano de hefateog protelycan específica da membrana do porão (Hspg2)35 apresentaram um enriquecimento ainda mais robusto no SEZ (em comparação com o MEZ) nas amostras de LCM do que nas amostras de CSD (não mostradas). Assim, o CSD pode fornecer amostras de tecido que fornecem um proteome quantitativo preciso e profundo para caracterização de SEZ em um prazo razoável, sem se preocupar com a integridade do tecido comprometida ou perda de proteínas. EstatísticaTestes estatísticos, testes de enriquecimento de anotação 2D e PCA foram feitos no ambiente Perseus. As proteínas foram incluídas na análise se um valor válido foi detectado para cada método em pelo menos uma amostra. A abundância de proteínas e as comparações numédicas foram visualizadas por meio de software de análise de dados (ver a Tabela de Materiais). Foi utilizado um controle baseado em permutação da taxa de detecção falsa (FDR) (FDR) (FDR) para 0,05,250 randomizações. Para os testes de enriquecimento de anotação 2D36, os termos go exibidos são significativamente enriquecidos (FDR foi definido como 0,02 usando o método de controle FDR Benjamini-Hochberg). Figura 1: O método crio-seção-dissecção. (A) Visão geral da região de interesse: o ventrículo lateral com o SEZ neurogênico e o MEZ não neurogênico. Neuroblastos imunossutos com Dcx. (B) Remoção stepwise do OB, o polo anterior, o córtex e o caloso corpus acima dos ventrículos e o plexo coroide: 1. colocação em meio de dissecção, 2. remoção de OB, 3. remoção do polo anterior do córtex, 4. incisões sagitarais do topo ventricular, 5. remoção do topo ventricular, 5. remoção do topo ventricular, 5. remoção do topo ventricular, 5. 6. espalhando-se das paredes ventriculares. (C) 100 μm de fatias coronais do cérebro do rato congelado fresco, (1.) antes e (2.) após a remoção das paredes ventriculares com um bisturi gelado. Barras de escala = 4 mm (D) Coloração de uma seção coronal de um ventrículo lateral (GFAP: verde; DAPI: azul), mostrando o SEZ e MEZ dissecados com o CSD. Barras de escala = 300 μm (A), 200 μm (D). Abreviaturas: CSD = dissecção crio-seção; SEZ = zona subependímal; MEZ = zona ependímal medial; Dcx = Doublecortin; OB = lâmpada olfativa; GFAP = proteína ácida fibrilar gliana; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Superior dissecção-precisão com a dissecação crio-seção-dissecção em comparação com dissecção integral. (A) Imagem imunohistoquímica de uma amostra de SEZ obtida por dissecção integral (esquerda). A inclusão do tecido estriatal rico em mielina é visualizada pela coloração contra mag (verde). Mancha de um SEZ dissecado com o CSD (à direita). No CSD, quase toda a mielina striatal (mancha contra MAG, verde) é excluída da fita de amostra. Os núcleos foram visualizados utilizando DAPI (azul). (B) Comparação do enriquecimento do marcador de mielina em SEZ vs. Cx de integral (MBP: p = 0,0074; MAG: p = 0,0016; Plp1: p = 0,0011; CNP: p = 0,0029) e CSD (MBP: p = 0,0667; MAG: p = 0,0236; Plp1: p = 0,3420; CNP: p = 0,1842). (C) teste de enriquecimento de anotação 2D comparando toda a soma-SEZ com as amostras de CSD-SEZ. Os termos GO espaço extracelular e matrisome associados são mais enriquecidos nos dados do CSD do que em todos os dados de valor. (D) A abundância de proteína do regulador NSC Tgm225 plotou para toda a dissecção de valores e o CSD. O Tgm2 é significativamente enriquecido no SEZ em comparação com o Cx em CSD (CSD: p = 0,0029; Valor integral: p = 0,1775). Para B e D: Como referência, dados proteome de Sharma et al.33 com medidas de estriatum e córtex plotados para as proteínas correspondentes exibidas em toda a quantidade e amostras de CSD. Barras de escala = 200 μm (A). Abreviaturas: CSD = dissecção crio-seção; SEZ = zona subependímal; MAG = glicoproteína associada à mielina; Cx = córtex somatosensorial; MBP = proteína básica de mielina; Plp1 = proteína proteolipida 1; CNP = 2′,3′-cíclico-nucleotídeo 3′-fosfodiesterase; GO = ontologia genética; NSC = célula-tronco neural; Tgm2 = tranglutaminase 2; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole; LFQ = quantitação sem rótulos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Melhor quantificação de proteína extracelular com dissecção crio-seção em comparação com a coloração violeta de Cresyl LCM de um ventrículo lateral antes e depois da captura a laser do SEZ e MEZ (esquerda). Para comparação, a incisão de CSD do SEZ e MEZ (à direita). Barras de escala = 150 μm. (B) Comparação do número de proteínas detectadas nas amostras de SEZ e MEZ de CSD e LCM. Os dados são apresentados como média ± SD. (C) Análise principal dos componentes das amostras de SEZ e MEZ comparando CSD e LCM (componente 2: 8,5% da variância; componente 3: 6,4%). (D) enriquecimento de anotação 2D do MEZ (Superior) e dissecado a laser (Topo) e SEZ (Inferior). Os termos GO organela extracelular e parte da região extracelular são significativamente enriquecidos (pontos vermelhos). (E) Abundâncias de proteínas marcadoras extracelulares associadas ao SEZ em SEZ e MEZ para LCM (Tnc: p = 0,3789) e as amostras de CSD (Tgm2: p = 0,2940; S100a6: p = 0,0218; THBS4: p = 0,3941; Tnc: p = 0,0004). Abreviaturas: CSD = dissecção crio-seção; LCM = microdisseção de captura a laser; SEZ = zona subependímal; MEZ = zona ependímal medial; GO = ontologia genética; Tnc = Tenacin-C; Tgm2 = transglutaminase 2; S100a6 = Proteína de ligação de cálcio S100 A6; THBS4 = trombospondina-4; LFQ = quantitação sem rótulos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O método CSD possibilitou extrair precisamente tecido SEZ e gerar um proteome confiável com profundidade significativa usando MS. O CSD apresenta uma clara vantagem em comparação com a dissecção integral em termos de contaminação striatal muito reduzida de amostras de SEZ e enriquecimento de proteína extracelular. Como também é possível detectar um número semelhante de proteínas em amostras individuais (~6.500 proteínas por amostra) com CSD e dissecção integral, o tempo adicional para CSD vale a pena o esforço. O LCM fornece dissecção DE SEZ mais precisa, mas atingiu uma profundidade proteome mais baixa, com apenas 3.500 proteínas por amostra, apesar de usar o mesmo protocolo de MS que o CSD (correspondência de biblioteca e quantificação sem rótulo). É importante ressaltar que a variabilidade foi muito maior, provavelmente devido ao oito vezes maior tempo de preparação por amostra. O PCA das amostras obtidas por LCM e CSD revela uma clara separação de ambos os métodos com clusters específicos de região apertados fortemente separados um do outro. Em contraste, as amostras de LCM apresentaram uma distribuição mais dispersa, que provavelmente é em parte devido ao tempo de preparação. Não está claro se a coleta de muito mais amostras durante um período mais longo teria rendido um proteome de igual robustez e profundidade com LCM. Calculando uma estimativa, a coleta de um volume amostral semelhante ao feito para CSD levaria de 5 a 8 vezes mais tempo com LCM, mesmo que até 15 vezes mais tempo se as amostras fornecidas para as bibliotecas de espectros de peptídeos fossem incluídas, e grande parte dela em condições descongeladas. Além disso, considerando as perturbações adicionais do tecido necessário para LCM (coloração de fundo, dissecção a laser), o LCM proporcionou pouco, se houver, ganho sobre o CSD. Assim, o CSD pode ser considerado mais adequado para pesquisas proteome extracelulares, especificamente para o SEZ.

Notavelmente, se a região de interesse for menor que a SEZ (por exemplo, investigando apenas a camada celular ependímal), uma abordagem à mão livre fica por trás da precisão do LCM. Por exemplo, o uso do CSD para separar o ependímico da camada subependímal é difícil, pois a camada ependímal tem apenas um diâmetro celular de largura, e a demarcação para a camada subependímal não é visível a olho nu em tecido congelado fresco. Assim, o LCM será uma escolha melhor do que o CSD se uma dissecção precisa em uma escala abaixo de 50 μm for mais importante do que o tecido não perturbado ou manter o tempo de dissecção curto. Para regiões com largura de 50 μm e mais, no entanto, a precisão do CSD é comparável à do LCM para análise de proteína ECM.

O CDS já se mostrou útil contribuindo para a investigação do papel funcional do ECM no nicho neurogênico25. Assim, a continuação da aplicação de CSD no SEZ para várias investigações proteicas e proteomas (ou mesmo sequenciamento de RNA de núcleo único) pode levar à detecção de novos reguladores de neurogênese, marcadores de ativação de células-tronco e uma compreensão mais profunda da fisiologia do nicho de células-tronco sez. Considerando o declínio da neurogênese no envelhecimento do SEZ37, uma análise concisa das alterações do ECM do SEZ de camundongos idosos versus jovens pode promover a compreensão dos mecanismos exatos de nicho que promovem o desenvolvimento e manutenção do NSC38,39. Além disso, a influência da inflamação e lesão na neurogênese sez é bem estabelecida 40,41,42,43. O enriquecimento do fibrinogênio derivado do sangue no SEZ após lesão cerebral cortical e sua influência na astrogliogênese e formação de cicatrizes do SEZ44 destaca a influência potencial das alterações de microambiente induzidas por trauma na fisiologia das células-tronco do SEZ. Assim, investigar o proteome SEZ-ECM em associação com lesões cerebrais usando CSD poderia ajudar a elucidar os mecanismos pelos quais lesões e inflamações afetam a neurogênese. É importante ressaltar que o método também pode ser aplicável a nichos neurogênicos cerebrais humanos em saúde e doença, uma vez que o tecido congelado fresco pode muitas vezes ser obtido a partir de cirurgias. Além disso, dadas as diferenças de espécies na neurogênese adulta, também seria fascinante aplicar o método CSD a outras espécies, por exemplo, em associação à neurogênese estriatal. Além disso, com outros métodos de detecção de proteínas, as diferenças nos fatores de crescimento produzidos localmente podem ser investigadas com precisão e eficiência usando ODS para o SEZ e MEZ (por exemplo, ELISA).

Por fim, o procedimento de dissecção poderia potencialmente ser modificado para extração precisa de outras regiões cerebrais, também para questões de pesquisa não relacionadas à neurogênese. Por exemplo, o CSD inclui uma breve etapa de semi-descongelamento, durante a qual a mielina compacta é visível como áreas brancas distintas do tecido cerebral residual mais translúcido. Com uma simples modificação do método, este recurso permitiria a dissecção precisa do tecido de mielina compacto corpus calosum, que poderia ser submetido à análise proteômica de alterações relacionadas a lesões. Uma sugestão de uma modificação protocolar que permitiria a dissecção insensível do corpus é omitir as etapas 1.5-1.9 do protocolo e proceder diretamente à preparação das seções coronais em vez de abrir os ventrículos para tornar o SEZ e MEZ acessíveis. Em seguida, coloque as seções sobre gelo seco, levante brevemente e semi-descongele as fatias, e simplesmente remova o caloso corpus com um bisturi. Esta preparação deve agora estar pronta para qualquer análise que exija uma dissecção eficiente do tecido de caloso de corpus nativo.

Em resumo, este estudo apresenta um método de microdiscção que poderia ser usado para uma análise proteome de nicho neurogênico ventricular confiável. Os dados sublinham a compatibilidade e utilidade do método CSD juntamente com a análise proteômica baseada em MS do microambiente SEZ. A combinação de precisão, eficiência e perturbação mínima do tecido tornam o CSD uma extensão valiosa dos métodos existentes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Queremos agradecer sinceramente a Mathias Mann por nos permitir realizar grandes partes dos experimentos em seu laboratório, Fabian Coscia por ajuda com lCM e análise de proteome, Tatiana Simon-Ebert para dissecções completas, e Korbinian Mayr e Igor Paron por sua ajuda técnica. Agradecemos o financiamento do Conselho Alemão de Pesquisa para MG (SFB870, TFR274), a UE (Eranet S-700982-5008-001), a ERC (aERC “NeuroCentro” para MG), a Sociedade Sueca de Pesquisa Médica (SSMF, a JK) pós-doutorado, e as fundações e fundos KI (2020-01351, para JK).

Materials

Cryostat CM3050S Leica
Dissecting microscope Leica
Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip Fine Science Tools cat. no. 11252-00
Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 Invitrogen cat. no. 24020
HEPES buffer solution (1 M) Invitrogen cat. no. 15630
Microscope slides RS France cat. no. BPB018
Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL Eppendorf cat. no. 0030123344
Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm Fine Science Tools cat. no. 15003-08
Surgical disposable scalpels B. Braun cat. no. 5518083
Tissue culture dishes 60 mm Greiner Bio-One cat. no. 633180
Antibodies
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) ThermoFisher Scientific cat. no. A-11001
DAPI Sigma cat. no. D9542
guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 Millipore cat. no. AB2253,
mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 Sigma cat. no. G3893
mouse monoclonal anti-MAG 1:400 Millipore cat. no. MAB1567
Software
GraphPad Prism version 9 GraphPad Software, San Diego California USA www.graphpad.com
Perseus Version 1.6.10.50 Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany https://maxquant.net/perseus/
ZEN imaging software Carl Zeiss
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Friess, C., Götz, M., Kjell, J. Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis. J. Vis. Exp. (176), e63047, doi:10.3791/63047 (2021).
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