冷冻切片解剖成人室管膜下区，用于准确和深入的定量蛋白质组分析

当遵循上述步骤时，微量离心管中的组织样品已准备好并与MS样品制备兼容。样品制备后，我们每只小鼠获得约5-7μgSEZ或MEZ样品的肽。然而，肽的最终量可能取决于MS的制备方法。在下面的蛋白质组比较中，通过将肽谱与为每个组织区域创建的肽谱库进行计算匹配，增加了蛋白质鉴定和定量深度（每个样品500-1，000个蛋白质）25，27。值得注意的是，这里用于创建肽谱库的无损纳米分馏方法目前尚未上市。使用MaxQuant软件28分析原始MS数据，实现了十亿分之一范围内的质量精度29。Max Quant 环境允许在 MS 运行之间进行匹配。使用无标记定量算法定量蛋白质丰度30。在新鲜冷冻组织上进行免疫组织化学染色，并如前所述进行25 （见 材料表）。 冷冻切片解剖使用CSD获得成年小鼠的完整SEZ和MEZ（n = 4）（见 图1 和方案）。用手术剪刀解剖躯体感觉皮层（Cx）。以相同的方式解剖另外4只小鼠;然而，将解剖的组织汇集到每个区域一个样品中，以创建蛋白质组文库（10，923种已鉴定的蛋白质），以增加单个样品中的蛋白质鉴定和定量25。在四个单独的样本中，（平均±SD）在经济特区定量了6，673±317.4个蛋白质，在MEZ中量化了6，747个±37.7个蛋白质。所有MS蛋白质组学数据都通过PRIDE31 合作伙伴存储库存放在ProteomeXchange联盟中，此处报告的蛋白质组的加入号是ProteomeXchange：PXD016632（http://proteomecentral.proteomexchange.org）。 与全挂式解剖的比较全挂解剖是根据标准协议进行的26。与CSD25相比，Wholemount解剖显示蛋白质数量相似（SEZ约为6，000，Cx约为6，000，每组n = 4）。在经济特区使用CSD而不是全山解剖方案的预期改进之一是减少潜在的纹状体污染。在被来自另一个区域的组织污染的经济特区样品中，检测到的候选蛋白不能分配到一个区域，因为感兴趣的区域和污染者可能会产生显着的富集。在免疫组织化学上，在全山样品中鉴定出纹状体的髓鞘相关糖蛋白（MAG）阳性的富含髓鞘的内部胶囊，但在CSD样品中很少（图2A）。通过鉴定经济特区中髓鞘蛋白的富集与体感皮层（Cx）灰质（GM）样品相比，可以确认全山样品中的纹状体污染（图2B）。请注意，Cx GM的大部分，尤其是上部Cx层，都是无髓鞘的32。 当大纤维束穿过纹状体时，与Cx相比，该区域的污染导致髓鞘蛋白的富集。在SEZ样品中用作纹状体污染标志物的髓鞘蛋白是髓鞘碱性蛋白（MBP），髓鞘相关糖蛋白（MAG），蛋白脂蛋白1（Plp1）和2’，3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶（Cnp）。与Cx相比，所有髓鞘标记蛋白在经济特区中均显着富集.相反，在比较SEZ和Cx时，CSD数据集中四种髓鞘标记蛋白的比较没有显着差异（图2B）。纹状体33 的蛋白质组学数据支持以下假设，即全坐体解剖的SEZ样品中髓鞘蛋白的富集是由纹状体组织的污染引起的。因此，与全上部解剖相比，CSD在很大程度上防止了纹状体组织（富含致密髓鞘）的污染。 对非解离组织的无偏蛋白质组分析可以揭示有趣的细胞外蛋白。使用CSD改进解剖，与全山样品相比，样品中的细胞外相关蛋白显着富集（图2C，注释富集测试）。CSD和全上位解剖显示出基因本体（GO）术语”细胞外囊泡外泌体”和”细胞外区域部分”的可比富集。然而，GO术语”母系体相关”在CSD中比在全山解剖中稍微丰富一些。因此，与使用CSD25的Cx相比，在经济特区中发现了ECM交联酶和最近发现的神经发生调节剂谷氨酰胺转移酶-2（Tgm2）。相比之下，通过全安装解剖获得的SEZ和Cx样品之间没有发现差异（图2D）。纹状体33 的蛋白质组学数据支持以下假设，即通过全上部剥离检测神经发生调节剂Tgm2受到纹状体组织污染的阻碍。因此，总体而言，冷冻切片解剖是对用于生态位特异性蛋白质组分析的标准解剖的成功但也是必要的改进。 与激光捕获显微镜的比较获得LECM的SEZ的前半部分和3只成年小鼠的MEZ（图3A）。总体而言，LCM方法表现出一些缺点，特别是在组织扰动和效率方面。为了在解剖显微镜下可视化感兴趣的区域，需要进行背景染色，可能会洗去感兴趣的小的或可溶性的蛋白质，例如生长因子，细胞因子或ECM调节剂，例如酶。此外，在激光去除过程中，载玻片在室温下花费不同的时间。此外，激光本身可能会使感兴趣的蛋白质变性。 在进行解剖所需的时间和精力方面，CSD比LCM具有相当大的优势：对于CSD和LCM，必须以类似的方式执行协议的步骤1;如果不采取这一步骤，心室壁仍然粘附，使得MEZ和SEZ样本的分离变得困难。鉴于CSD切片（100μm）比LCM切片的最大厚度34 （15μm）厚6-7倍，LCM的步骤2（大脑切片）和步骤3（从每个日冕切片中移除MEZ和SEZ）将至少需要6-7倍的时间。必要的背景染色和设置激光显微镜将消耗额外的时间。在这里，LCM收获3只动物的50%的经济特区和MEZ的时间是CSD的100%和4只动物的MEZ的100%的时间的三倍，构成了CSD的八倍速度优势。总之，LCM不仅需要大量的额外努力，而且组织还受到更长的操作和温度变化，这可能会损害后续分析生成的数据的动态和可靠性。 将CSD的MS结果与激光捕获显微切割（LCM）的结果进行比较。两个数据集都与通过汇集CSD样本生成的蛋白质组学库相匹配。平均而言，LCM在经济特区和内侧心室区分别产生了3，441±270.0和3，613±238.7个单独的蛋白质（图3B）。鉴于蛋白质鉴定的显着差异，主成分分析（PCA）根据解剖方法显示出明显的分离（成分1：62.7%，未显示）。组分2显示LCM样品中经济特区和MEZ的分离最大（8.5%， 图3C）。构成部分3似乎也将LCM和CSD分开;然而，这种差异可能是由基于方法的差异而不是已鉴定蛋白质的数量（6.4%）引起的。尽管如此，冷冻解剖数据的整体区域分离仍然截然不同，并且比LCM要好得多。数据动力学的这种差异可能是由于在激光解剖期间标本在室温下花费的不同时间，或者在随后的蛋白质组学方案和质谱测量中，小组织量对变异性的敏感性较高。 为了寻找ECM蛋白质组剖面的差异，对经济特区和MEZ进行了CSD和LCM之间的2D注释富集测试（图3D）。计算LCM和CSD样品之间GO项的相对富集允许比较两种方法之间ECM蛋白簇的相对蛋白质组动力学，尽管组织数量不等且解剖方案存在差异。这些图揭示了LCM和CSD之间的良好相关性。注释”细胞外区域部分”和”细胞外膜结合细胞器”在方法和区域中同样富集。因此，LCM增加的时间需求似乎并没有得到ECM相关蛋白质相对较高的灵敏度的补偿。相反，在比较神经发生和SEZ相关ECM蛋白Tgm2，血栓消退素-4（Thbs4），S100a6和Tenacin-C（Tnc）的样本数据时，CSD提供了更强大的鉴定/定量（图3E）。就TnC而言，尽管在所有样品中都进行了量化，但与MEZ相比，只有CSD显示出经济特区的富集。然而，与经济特区相关的基底膜蛋白Nidogen-1（Nid1），层粘连蛋白亚基β-2（Lamb2）和基底膜特异性硫酸肝素蛋白聚糖核心蛋白（Hspg2）35在LCM样品中在经济特区（与MEZ相比）显示出比CSD样品（未显示）更强的富集。因此，CSD可以提供组织样品，在合理的时间范围内为经济特区表征提供准确和深入的定量蛋白质组，而不必担心组织完整性受损或蛋白质损失。 统计学统计测试，2D注释丰富测试和PCA是在Perseus环境中完成的。如果在至少一个样品中检测到每种方法的有效值，则将蛋白质包括在分析中。使用数据分析软件可视化蛋白质丰度和数量比较（见 材料表）。采用基于排列的假发现率（FDR）控制（FDR设置为0.05，250个随机化）进行蛋白质比较。对于 2D 注释扩充测试36，显示的 GO 项显著丰富（使用 Benjamini-Hochberg FDR 控制方法将 FDR 设置为 0.02）。 图1： 低温切片解剖法。 （A）感兴趣区域概述：具有神经源性经济特区和非神经源性MEZ的侧脑室。（B）逐步切除OB，前极，皮层和脉络丛上方的胼胝体：1.放置在夹层培养基中，2.切除OB，3.切除皮层前极，4.心室顶部的矢状切口，5.切除心室顶部， 6.心室壁扩散。（C）新鲜冷冻的小鼠大脑的100μm日冕切片，（1.）在用冰冷的手术刀切除心室壁之前和（2.）之后。比例尺 = 4 mm （D） 侧脑室冠状切片染色（GFAP： 绿色;DAPI： 蓝色），显示经济特区和MEZ与CSD剖析。比例尺 = 300 μm （A），200 μm （D）。缩写：CSD = 冷冻切片解剖;经济特区= 室管膜下区;MEZ = 内侧室管膜区;Dcx = 双皮质素;OB = 嗅球;GFAP = 神经胶质纤维酸性蛋白;DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的放大版本。 图2： 与全上位解剖相比，冷冻截面解剖的解剖精度更高。 （A）通过全上位解剖获得的SEZ样品的免疫组化图像（左）。通过对MAG（绿色）进行染色来可视化富含髓鞘的纹状体组织的内含物。用CSD解剖的经济特区染色（右）。在CSD中，几乎所有的纹状髓鞘（针对MAG的染色，绿色）都从样品带中排除。使用DAPI（蓝色）可视化细胞核。 （B）经济特区髓鞘标记富集与整山Cx的比较（MBP：p = 0.0074;MAG： p = 0.0016;Plp1： p = 0.0011;CNP： p = 0.0029） 和 CSD （MBP： p = 0.0667;MAG： p = 0.0236;Plp1： p = 0.3420;CNP： p = 0.1842）。（C） 将整个山区经济特区与CSD-经济特区样本进行比较的二维注释丰富试验。GO术语细胞外空间和母体相关在CSD数据中比在全装载数据中更丰富。（D）绘制的用于全山解剖和CSD的NSC调节剂Tgm225的蛋白质丰度。与CSD的Cx相比，Tgm2在经济特区中显着丰富（CSD：p = 0.0029;整装：p = 0.1775）。对于 B 和 D：作为参考，来自Sharma等人的蛋白质组数据33 ，以及纹状体和皮层的测量值，绘制了全山和CSD样品中显示的相应蛋白质。比例尺 = 200 μm （A）。缩写：CSD = 冷冻切片解剖;经济特区= 室管膜下区;MAG = 髓鞘相关糖蛋白;Cx = 躯体感觉皮层;MBP = 髓鞘碱性蛋白;Plp1 = 蛋白脂蛋白 1;CNP = 2’，3′-环核苷酸 3′-磷酸二酯酶;GO = 基因本体;NSC = 神经干细胞;Tgm2 = 三氟-谷氨酰胺酶 2;DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚;LFQ = 无标签定量。 请点击此处查看此图的放大版本。 图3：与LCM相比，冷冻切片解剖改善了细胞外蛋白质定量（A）在SEZ和MEZ激光捕获之前和之后对侧心室进行Cresyl紫色染色（左）。相比之下，经济特区和MEZ的CSD切口（右）。比例尺 = 150 μm. （B） 来自 CSD 和 LCM 的经济特区和 MEZ 样品中检测到的蛋白质数量的比较。（C）经济特区 ±和MEZ样本的主成分分析比较CSD和LCM（成分2：方差的8.5%;成分3：6.4%）。（D） 冷冻截面和激光解剖 MEZ（上图）和 SEZ（下图）的 2D 注释富集。GO术语细胞外细胞器和细胞外区域部分明显富集（红点）。（E） 经济特区和MEZ中用于LCM（Tnc：p = 0.3789）和CSD样品（Tgm2：p = 0.2940;S100a6： p = 0.0218;THBS4： p = 0.3941;Tnc： p = 0.0004）。缩写：CSD = 冷冻切片解剖;LCM = 激光捕获显微切割;经济特区= 室管膜下区;MEZ = 内侧室管膜区;GO = 基因本体;Tnc = 替那辛-C;Tgm2 = 谷氨酰胺转移酶 2;S100a6 = S100钙结合蛋白A6;THBS4 = 血小板-4;LFQ = 无标签定量。请点击此处查看此图的放大版本。