미세주입에 의한 스트 롱실로이드 종에서 형질전환 및 녹아웃 생성
Summary
기생 선충류 Strongyloides stercoralis 및 Strongyloides ratti 에 대한 기능적 게놈 툴킷에는 트랜스제네시스, CRISPR/Cas9 매개 돌연변이유발 및 RNAi가 포함됩니다. 이 프로토콜은 성선 내 미세주사를 사용하여 전이유전자 및 CRISPR 성분을 S. stercoralis 및 S. ratti에 도입하는 방법을 입증할 것이다.
Abstract
Strongyloides 속은 Strongyloides stercoralis 및 Strongyloides ratti를 포함하여 다양한 숙주 범위를 가진 여러 종의 피부 침투 선충류로 구성됩니다. S. stercoralis는 약 610 만 명의 사람들을 감염시키는 인간 기생충, 피부 침투 선충류이며, 쥐 기생충 S. ratti는 S. stercoralis와 밀접한 관련이 있으며 종종 S. stercoralis의 실험실 모델로 사용됩니다. S. stercoralis 및 S. ratti 둘 다 성선 내 미세주사의 외인성 핵산 전달 기술을 통해 트랜스제닉 및 녹아웃의 생성에 쉽게 적응할 수 있으며, 따라서 아직이 기술에 적용 가능하지 않은 다른 기생충에 대한 모델 시스템으로 부상했습니다.
기생충 Strongyloides 성인은 숙주의 소장에 서식하며 대변을 통해 자손을 환경으로 방출합니다. 일단 환경에 들어가면, 애벌레는 배설물에 살고 새로운 숙주를 찾아 침략해야하는 자손을 생산하는 자유 생활 성인으로 발전합니다. 이러한 환경 생성은 Strongyloides 종에 고유하며 C. elegans를 위해 개발 된 기술이 성선 내 미세 주사를 포함하여 이러한 기생충 선충류와 함께 사용하도록 적응 될 수있는 모델 자유 살아있는 선충류 Caenorhabditis elegans 와 형태학적으로 충분히 유사합니다 . 성선 내 미세주사를 사용하여, 매우 다양한 전이유전자가 스트롱실로이드에 도입될 수 있다. CRISPR / Cas9 성분은 또한 돌연변이 Strongyloides 애벌레를 만들기 위해 미세 주입 될 수 있습니다. 여기에서, 자유 생존 성인의 제조, 주사 절차 및 트랜스제닉 자손의 선택을 포함하는 스트롱실로이드 로의 성선 내 미세주사의 기술이 기재되어 있다. CRISPR/Cas9 돌연변이유발을 사용하여 만든 형질전환 스트롱실로이드 유충의 이미지가 포함되어 있습니다. 이 논문의 목적은 다른 연구자들이 미세 주입을 사용하여 트랜스제닉 및 돌연변이 스트롱 틸로이드를 만들 수있게하는 것입니다.
Introduction
스트롱실로이드 스테로이드는 더 널리 알려진 갈고리벌레 및 회충 Ascaris lumbricoides1에 비해 중요한 인간 병원체로서 오랫동안 간과되어 왔다. 웜 부담에 대한 이전의 연구는 종종 S. stercoralis 2에 대한 일반적인 진단 방법의 민감도가 낮기 때문에 S. stercoralis의 유병률을 심각하게 과소 평가했습니다. 최근 몇 년 동안, 개선 된 진단 도구에 기초한 역학 연구는 S. stercoralis 감염의 진정한 유병률이 이전에보고 된 것보다 훨씬 높다고 추정했다(전 세계적으로 약 610 만 명).
밀접한 관련이 있는 쥐 기생충과 일반적인 실험실 모델 S. ratti를 포함한 S. stercoralis 및 다른 Strongyloides 종은 모두 기생 및 자유 생활 (환경) 세대 3으로 구성되어 있기 때문에 실험 게놈 연구에 유리한 비정상적인 수명주기를 가지고 있습니다 (그림 1). 특히, S. stercoralis와 S. ratti 모두 단일 자유 생활 세대를 통해 순환 할 수 있습니다. 자유 생활 세대는 자유롭게 사는 성인 남성과 여성으로 발전하는 기생 후 애벌레로 구성됩니다. 자유롭게 사는 성인의 모든 자손은 감염성 애벌레로 발전하며, 이는 수명주기를 계속하기 위해 숙주를 감염시켜야합니다. 또한,이 환경 또는 자유 생활 세대는 실험실에서 실험적으로 조작 될 수 있습니다. 자유 생활 Strongyloides 성인과 C. elegans 성인은 유사한 형태를 공유하기 때문에 원래 C. elegans를 위해 개발 된 성선 내 미세 주사와 같은 기술은 자유 생활 성인 Strongyloides 4,5와 함께 사용하도록 적용 할 수 있습니다. DNA는 일반적으로 자유 생활 성인 여성에게 도입되지만, 스트롱 틸로이드의 남성과 여성 모두 미세 주입 될 수 있습니다6. 따라서, 기능적 게놈 도구는 스트롱실로이드의 생물학의 많은 측면을 심문하기 위해 이용가능하다. 다른 기생 선충류는 자유 생존 세대가 부족하고, 결과적으로 기능적 게놈 기술에 쉽게 적응할 수 없다3.
그림 1: 스트롱실로이드 스테로이드 수명주기. S. stercoralis 기생 암컷은 포유류 숙주 (인간, 비 인간 영장류, 개)의 소장에 서식합니다. 기생 여성은 분파 발생에 의해 번식하고 소장 내에 알을 낳습니다. 알은 숙주 안에있는 동안 부화하여 기생 후 애벌레로 변한 다음 대변이있는 환경으로 전달됩니다. 기생 후 애벌레가 수컷 인 경우, 그들은 자유롭게 사는 성인 남성으로 발전합니다. 기생 후 유충이 암컷 인 경우, 자유 생활 성인 암컷 (간접 발달) 또는 3 단계 감염성 유충 (iL3s; 직접 발달)으로 발전 할 수 있습니다. 자유롭게 사는 남성과 여성은 성적으로 번식하여 iL3가되도록 제한받는 자손을 만듭니다. 특정 조건 하에서, S. stercoralis는 또한 대변의 환경으로 통과하기보다는 기생 후 유충 중 일부가 숙주 장 내부에 남아있는 자동 감염을 겪을 수 있습니다. 이 유충은 숙주 내부에서자가 감염 유충 (L3a)으로 발전하여 장 벽을 관통하고 신체를 통해 이동하며 결국 장으로 돌아와 생식 성인이 될 수 있습니다. S. ratti의 수명주기는 S. ratti가 쥐를 감염시키고 자동 감염주기가 없다는 점을 제외하고는 유사합니다. 환경 생성은 유전 연구에 Strongyloides 종을 사용하는 열쇠입니다. 자유 생존 성인 여성 (P0)은 미세 주입 될 수있다; 모두 iL3s가 될 그들의 자손은 잠재적 인F1 트랜스제닉입니다. 이 그림은 Castelletto et al.에서 수정되었습니다. 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
S. stercoralis는 숙주 침범 및 숙주 면역 조절을 포함한 다른 위장 인간 기생 선충류와 생물학의 많은 측면을 공유합니다. 예를 들어, Necator 및 Ancylostoma 속의 인간 기생 갈고리 벌레는 또한 피부 침투에 의해 감염되고, 신체를 통해 유사하게 탐색하며, 궁극적으로 소장7에서 기생 성인으로 거주합니다. 따라서 많은 위장 선충류는 일반적인 감각 행동과 면역 회피 기술을 사용할 가능성이 큽니다. 결과적으로, Strongyloides 에서 수집 된 지식은 유전적으로 덜 다루기 쉬운 다른 선충류의 발견을 보완하고 이러한 복잡하고 중요한 기생충에 대한보다 완전한 이해로 이어질 것입니다.
이 미세 주입 프로토콜은 트랜스제닉 및 돌연변이 자손을 만들기 위해 Strongyloides 자유 생활 성인 여성에게 DNA를 도입하는 방법을 설명합니다. 미세주사를 위한 성인 웜의 발달 시기 및 형질전환 자손의 수집을 포함하는 균주 유지 요건이 설명된다. 프로토콜 및 완전한 미세 주입 기술의 시연과 함께 트랜스제닉 자손을 배양하고 스크리닝하기위한 프로토콜이 포함되어 있으며 필요한 모든 장비 및 소모품 목록이 포함되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 미세주입 프로토콜 은 S. stercoralis 및 S. ratti에 트랜스제네시스 및 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이유발을 위한 작제물을 도입하는 방법을 상세 히 기술한다. S. stercoralis 및 S. ratti 둘 다에 대해, 주사 후 생존 및 형질감염 또는 돌연변이 유발의 속도는 미세 조정될 수 있는 몇 가지 변수의 적용을 받는다.
성공적인 전이형성을 위한 첫 번째 중요한 고려 사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pPV540과 pPV402는 펜실베니아 대학의 제임스 록 박사의 친절한 선물이었다. 원고에 대한 유용한 의견을 주신 Astra Bryant에게 감사드립니다. 이 연구는 Burroughs-Wellcome Fund Investigators가 Pathogenesis of Disease Award, Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award 및 National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.)의 자금을 지원했습니다.
Materials
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
References
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