On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

Aufgrund der ionisierenden Wirkung von Röntgenstrahlung war die Proteinkristallographie in den letzten drei Jahrzehnten weitgehend auf kryogene Bedingungen beschränkt. Daher ergibt sich das aktuelle Wissen über Proteinbewegungen während seiner Funktion weitgehend aus Vergleichen zwischen statischen Strukturen, die in verschiedenen Zuständen unter kryogenen Bedingungen beobachtet wurden. Kryogene Temperaturen behindern jedoch unweigerlich das Fortschreiten einer biochemischen Reaktion oder Interkonversion zwischen verschiedenen Konformationszuständen, während Proteinmoleküle arbeiten. Um die Proteinstrukturdynamik mit atomarer Auflösung direkt durch Kristallographie zu beobachten, sind robuste und routinemäßige Methoden zur Durchführung von Beugungsexperimenten bei Raumtemperatur erforderlich, was technische Innovationen in der Probenabgabe, Datenerfassung und posterioren Datenanalyse erfordert. Zu diesem Zweck haben die jüngsten Fortschritte in der seriellen Kristallographie neue Wege eröffnet, um die molekularen Bilder von Zwischenprodukten und kurzlebigen Strukturspezies bei Raumtemperatur ^1,2,3 aufzunehmen. Im Gegensatz zu der in der konventionellen Kryokristallographie weit verbreiteten “Ein-Kristall-ein-Datensatz”-Strategie verfolgt die serielle Kristallographie eine Datenerfassungsstrategie, die der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie ähnelt. Konkret werden die experimentellen Daten in der seriellen Kristallographie in kleinen Fraktionen aus einer großen Anzahl von Einzelproben gesammelt, gefolgt von einer intensiven Datenverarbeitung, bei der Datenfraktionen ausgewertet und zu einem vollständigen Datensatz zur 3D-Strukturbestimmung zusammengeführt werden⁴. Diese “One-Crystal-One-Shot”-Strategie mildert effektiv die Röntgenstrahlungsschädigung von Proteinkristallen bei Raumtemperatur durch eine Beugung vor der Zerstörungsstrategie⁵.

Da die serielle Kristallographie eine große Anzahl von Proteinkristallen benötigt, um einen Datensatz zu vervollständigen, stellt sie viele biologische Systeme, in denen Proteinproben begrenzt sind und/oder eine empfindliche Kristallhandhabung erforderlich ist, vor große technische Herausforderungen. Eine weitere wichtige Überlegung ist, wie die Kristallintegrität in seriellen Beugungsexperimenten am besten erhalten werden kann. Die In-situ-Beugungsmethoden adressieren diese Bedenken, indem sie es Proteinkristallen ermöglichen, direkt von dort zu beugen, wo sie wachsen, ohne die Versiegelung der Kristallisationskammer 6,7,8,9 zu brechen. Diese handhabungsfreien Verfahren sind selbstverständlich kompatibel mit großflächiger serieller Beugung. Wir haben kürzlich über das Design und die Implementierung einer Kristallisationsvorrichtung für die In-situ-Beugung berichtet, die auf einem Crystal-on-Crystal-Konzept basiert – Proteinkristalle, die direkt auf monokristallinem Quarz¹¹ gezüchtet werden. Dieses “Kristall-auf-Kristall”-Gerät bietet mehrere Vorteile. Erstens verfügt es über ein röntgen- und lichttransparentes Fenster aus einem monokristallinen Quarzsubstrat, das wenig Hintergrundstreuung erzeugt, was zu hervorragenden Signal-Rausch-Verhältnissen in Beugungsbildern von Proteinkristallen führt. Zweitens ist der einkristalline Quarz eine ausgezeichnete Dampfsperre, die Glas entspricht und somit eine stabile Umgebung für die Proteinkristallisation bietet. Im Gegensatz dazu neigen andere Kristallisationsvorrichtungen, die polymerbasierte Substrate verwenden, aufgrund der Dampfdurchlässigkeit zum Austrocknen, es sei denn, das Polymermaterial weist eine erhebliche Dicke auf, was folglich zu einer hohen Hintergrundstreuung beiträgt¹⁰. Drittens ermöglicht dieses Gerät die Abgabe einer großen Anzahl von Proteinkristallen an den Röntgenstrahl ohne jegliche Form von Kristallmanipulation oder -ernte, was für die Erhaltung der Kristallintegrität entscheidend ist¹¹.

Um serielle Röntgenbeugungsexperimente mit den Crystal-on-Crystal-Geräten zu rationalisieren, haben wir einen Diffraktometer-Prototyp entwickelt, der ein einfaches Umschalten zwischen den optischen Scanning- und Röntgenbeugungsmodi¹² erleichtert. Dieses Diffraktometer hat einen geringen Platzbedarf und wurde für die serielle Datenerfassung an zwei Beamlines der Advanced Photon Source (APS) am Argonne National Laboratory verwendet. Konkret haben wir BioCARS 14-ID-B für die Laue-Beugung und LS-CAT 21-ID-D für die monochromatische Oszillation verwendet. Diese Diffraktometer-Hardware ist nicht erforderlich, wenn eine Synchrotron- oder Röntgen-Freie-Elektronen-Laser-Beamline mit zwei Schlüsselfunktionen ausgestattet ist: (1) motorisierte Probenpositionierung mit einem Verfahrbereich von ±12 mm um den Röntgenstrahl in alle Richtungen; und (2) eine On-Axis-Digitalkamera für die Kristallbetrachtung unter Lichtbeleuchtung, die für untersuchte Proteinkristalle sicher ist. Das monokristalline Quarzgerät bildet zusammen mit einem tragbaren Diffraktometer und der Steuerungssoftware für optisches Scannen, Kristallerkennung und automatisierte In-situ-Datenerfassung die inSituX-Plattform für die serielle Kristallographie. Obwohl diese Entwicklung in erster Linie durch ihre dynamischen Kristallographie-Anwendungen mit einer polychromatischen Röntgenquelle motiviert ist, haben wir das Potenzial dieser Technologie zur Unterstützung monochromatischer Oszillationsmethoden^10,12 demonstriert. Mit Automatisierung bietet diese Plattform eine serielle Datenerfassungsmethode mit hohem Durchsatz bei Raumtemperatur mit erschwinglichem Proteinverbrauch.

In diesem Beitrag beschreiben wir im Detail, wie man die On-Chip-Kristallisation in einem Nasslabor aufbaut und wie man serielle Röntgendatenerfassung an einer Synchrotron-Beamline mit der inSituX-Plattform durchführt.

Die Batch-Methode wird verwendet, um eine On-Chip-Kristallisation unter einer ähnlichen Bedingung wie die Dampfdiffusionsmethode für dieselbe Proteinprobe einzurichten (Tabelle 1). Als Ausgangspunkt empfehlen wir, Fällungsmittel in einer 1,2-1,5-fachen Konzentration für die Dampfdiffusionsmethode zu verwenden. Bei Bedarf kann die Chargenkristallisation durch Feingittersiebung weiter optimiert werden. Quarzwafer sind für Optimierungsversuche nicht notwendig; Stattdessen können Glasdeckgläser verwendet werden (siehe unten). Teilweise beladene Kristallisationsgeräte werden empfohlen, um Optimierungsversuche in kleinerem Maßstab durchzuführen. Eine Reihe von Proteinproben wurde erfolgreich auf solchen Geräten unter Verwendung der Batch-Methode¹⁰ kristallisiert (Tabelle 1).

Das Gerät selbst besteht aus folgenden Teilen: 1) einem äußeren Ring; 2) zwei Quarzwafer; 3) eine scheibenartige Unterlegscheibe aus Kunststoff oder Edelstahl; 4) einen Sicherungsring; 5) Mikroskop-Tauchöl als Dichtmittel (Abbildung 1). Das Gesamtvolumen der Kristallisationslösung, die auf einen Chip geladen wird, hängt vom Zweck des Experiments ab. Die Kapazität der Kristallisationskammer kann durch Auswahl einer Unterlegscheibe unterschiedlicher Dicke und/oder Innendurchmesser eingestellt werden. Wir richten routinemäßig Kristallisationsgeräte mit einer Kapazität von 10-20 μL mit Scheiben von 50-100 μm Dicke ein. Ein typisches Gerät kann Zehntausende bis Tausende von Proteinkristallen produzieren, die für die serielle Datenerfassung geeignet sind (Abbildung 2).

Wenn die On-Chip-Kristallisation erfolgreich ist, werden Dutzende bis Hunderte oder sogar Tausende von Proteinkristallen auf jedem Quarzgerät erzeugt, die für die Röntgenbeugung bereit sind. An einer Synchrotron-Beamline wird eine solche Vorrichtung mittels eines kinematischen Mechanismus auf einem dreiachsigen Translationstisch des Diffraktometers montiert. Das Kristallisationsfenster eines montierten Gerätes wird optisch gescannt und in Dutzenden bis Hunderten von Mikroaufnahmen abgebildet. Diese Mikroaufnahmen werden dann zu einer hochauflösenden Montage zusammengefügt. Bei lichtempfindlichen Kristallen kann das optische Scannen unter Infrarotlicht (IR) durchgeführt werden, um eine unbeabsichtigte Photoaktivierung zu vermeiden. Eine Computer-Vision-Software wurde entwickelt, um zufällig auf dem Gerät verteilte Proteinkristalle zu identifizieren und zu lokalisieren. Diese Kristalle werden dann nach ihrer Größe, Form und Position eingestuft, um die Datenerfassungsstrategie in der seriellen Kristallographie zu informieren oder zu leiten. Zum Beispiel können einzelne oder mehrere Schüsse auf jedem Zielkristall lokalisiert werden. Benutzer konnten einen einzelnen Durchgang oder mehrere Routen durch gezielte Kristalle planen. Wir haben Software implementiert, um verschiedene Reiserouten zu berechnen. Zum Beispiel wird die kürzeste Route mit Algorithmen berechnet, die das Problem des Handlungsreisenden¹³ angehen. Für dynamische kristallographische Pump-Probe-Anwendungen können Zeitpunkt und Dauer von Laser- (Pump) und Röntgenaufnahmen (Sonde) gewählt werden. Eine automatisierte serielle Datenerfassung ist so programmiert, dass sie jeden Zielkristall nacheinander in den Röntgenstrahl transloziert.

Zu den wichtigsten Komponenten des insituX-Diffraktometers gehören: 1) ein Gerätehalter; 2) eine dreiachsige Übersetzungsstufe; 3) eine Lichtquelle für optisches Scannen; 4) ein Röntgenstrahlstopp; 5) Pumplaser, wenn lichtempfindliche Proteine untersucht werden; 6) Raspberry Pi Mikrocomputer mit einer IR-empfindlichen Kamera; 7) Steuerungssoftware zur Synchronisierung von Motoren, Kameras, Lichtquellen, Pumplaser und zur Schnittstelle mit Beamline-Steuerungen.