התגבשות על השבב ודיפרקציה טורית בקנה מידה גדול בטמפרטורת החדר

בשל ההשפעות המייננות של קרינת רנטגן, קריסטלוגרפיה של חלבונים, במידה רבה, הוגבלה לתנאים קריוגניים בשלושת העשורים האחרונים. לכן, הידע הנוכחי על תנועות חלבונים במהלך תפקודו נובע במידה רבה מהשוואות בין מבנים סטטיים שנצפו במצבים שונים בתנאים קריוגניים. עם זאת, טמפרטורות קריוגניות מעכבות בהכרח את התקדמות התגובה הביוכימית או את ההמרה בין מצבי קונפורמציה שונים בזמן שמולקולות חלבון פועלות. כדי לצפות ישירות בדינמיקה המבנית של חלבונים ברזולוציה אטומית על ידי קריסטלוגרפיה, יש צורך בשיטות חזקות ושגרתיות לביצוע ניסויי עקיפה בטמפרטורת החדר, מה שמחייב חידושים טכניים במסירת דגימות, איסוף נתונים וניתוח נתונים אחוריים. לשם כך, ההתקדמות האחרונה בקריסטלוגרפיה סדרתית הציעה דרכים חדשות ללכידת התמונות המולקולריות של חומרי ביניים ומינים מבניים קצרי מועד בטמפרטורת החדר ^1,2,3. בניגוד לאסטרטגיית “גביש אחד-אחד-אחד-מערך נתונים” הנמצאת בשימוש נרחב בקריוקריסטלוגרפיה קונבנציונלית, קריסטלוגרפיה סדרתית מאמצת אסטרטגיית איסוף נתונים הדומה לזו של מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים חד-חלקיקית. באופן ספציפי, נתוני הניסוי בקריסטלוגרפיה סדרתית נאספים בשברים קטנים ממספר רב של דגימות בודדות, ולאחר מכן עיבוד נתונים אינטנסיבי שבו שברי נתונים מוערכים ומשולבים לתוך מערך נתונים שלם לקביעת מבנה תלת מימדי⁴. אסטרטגיה זו של “גביש אחד בשוט אחד” מקלה ביעילות על נזקי קרינת הרנטגן לגבישי חלבון בטמפרטורת החדר באמצעות אסטרטגיית עקיפה לפני השמדה⁵.

מאחר שקריסטלוגרפיה סדרתית דורשת מספר רב של גבישי חלבון כדי להשלים מערך נתונים, היא מציבה אתגרים טכניים גדולים עבור מערכות ביולוגיות רבות שבהן דגימות חלבון מוגבלות ו/או טיפול עדין בגבישים מעורב. שיקול חשוב נוסף הוא כיצד לשמר בצורה הטובה ביותר את שלמות הגביש בניסויי עקיפה סדרתיים. שיטות עקיפה in situ מטפלות בחששות אלה בכך שהן מאפשרות לגבישי חלבון להתפזר ישירות מהמקום שבו הם גדלים מבלי לשבור את החותם של תא ההתגבשות 6,7,8,9. שיטות נטולות טיפול אלה תואמות באופן טבעי לעקיפה סדרתית בקנה מידה גדול. לאחרונה דיווחנו על תכנון ויישום של התקן התגבשות עבור עקיפה באתרה המבוססת על תפיסה של גביש על גביש – גבישי חלבון הגדלים ישירות על קוורץ מונוקריסטליני¹¹. מכשיר “קריסטל על גביש” זה מציע מספר יתרונות. ראשית, הוא כולל חלון שקוף של קרני רנטגן ואור העשוי ממצע קוורץ חד-קריסטלי, המייצר פיזור רקע מועט, ומכאן שהתוצאה היא יחסי אות לרעש מצוינים בתמונות עקיפה מגבישי חלבונים. שנית, הקוורץ החד-גבישי הוא מחסום אדים מצוין השווה ערך לזכוכית, ובכך מספק סביבה יציבה להתגבשות חלבונים. לעומת זאת, התקני התגבשות אחרים המשתמשים במצעים מבוססי פולימרים נוטים להתייבש עקב חדירות אדים אלא אם כן לחומר הפולימרי יש עובי משמעותי, וכתוצאה מכך תורם לפיזור רקע גבוה¹⁰. שלישית, מכשיר זה מאפשר משלוח של מספר רב של גבישי חלבון לקרן הרנטגן ללא כל צורה של מניפולציה או קציר גבישי, שהיא קריטית לשמירה על שלמות הגביש¹¹.

כדי לייעל את ניסויי עקיפת קרני הרנטגן הסדרתיים באמצעות התקני גביש על גביש, פיתחנו אב-טיפוס של דיפרקטומטר כדי להקל על המעבר הקל בין מצבי הסריקה האופטית למצב עקיפת קרני רנטגן¹². לדיפרקטומטר זה יש טביעת רגל קטנה והוא שימש לאיסוף נתונים סדרתי בשתי אלומות של מקור הפוטון המתקדם (APS) במעבדה הלאומית ארגון. באופן ספציפי, השתמשנו ב- BioCARS 14-ID-B עבור עקיפת Laue ו- LS-CAT 21-ID-D עבור תנודה מונוכרומטית. חומרת דיפרקטומטר זו אינה נדרשת אם קרן לייזר סינכרוטרון או רנטגן ללא אלקטרונים מצוידת בשתי יכולות עיקריות: (1) מיקום דגימה ממונעת עם טווח נסיעה של ±12 מ”מ סביב קרן הרנטגן לכל הכיוונים; ו-(2) מצלמה דיגיטלית על הציר לצפייה בגבישים תחת תאורת אור הבטוחה לגבישי חלבון הנחקרים. התקן הקוורץ המונוקריסטליני יחד עם דיפרקטומטר נייד ותוכנת הבקרה לסריקה אופטית, זיהוי גבישים ואיסוף נתונים אוטומטי באתרו מהווים יחד את פלטפורמת inSituX לקריסטלוגרפיה טורית. למרות שפיתוח זה מונע בעיקר על ידי יישומי הקריסטלוגרפיה הדינמית שלו באמצעות מקור רנטגן פוליכרומטי, הדגמנו את הפוטנציאל של טכנולוגיה זו לתמוך בשיטות תנודה מונוכרומטיות^10,12. עם אוטומציה, פלטפורמה זו מציעה שיטת איסוף נתונים טורית בתפוקה גבוהה בטמפרטורת החדר עם צריכת חלבון במחיר סביר.

בתרומה זו, אנו מתארים בפירוט כיצד להגדיר התגבשות על השבב במעבדה רטובה וכיצד לבצע איסוף נתוני רנטגן סדרתי בקו קרן סינכרוטרון באמצעות פלטפורמת inSituX.

שיטת האצווה משמשת להגדרת התגבשות על השבב במצב דומה לזה של שיטת דיפוזיית האדים המתקבלת עבור אותה דגימת חלבון (טבלה 1). כנקודת התחלה, אנו ממליצים להשתמש במקדם בריכוז של פי 1.2-1.5 מזה של שיטת דיפוזיית האדים. במידת הצורך, ניתן למטב עוד יותר את מצב התגבשות האצווה באמצעות סינון רשת עדין. פרוסות קוורץ אינן נחוצות לניסויי אופטימיזציה; במקום זאת ניתן להשתמש בכיסויי זכוכית (ראו בהמשך). התקני התגבשות טעונים חלקית מומלצים כדי לשמור על ניסויי אופטימיזציה בקנה מידה קטן יותר. מספר דגימות חלבון התגבשו בהצלחה על מכשירים כאלה בשיטת אצווה¹⁰ (טבלה 1).

המכשיר עצמו מורכב מהחלקים הבאים: 1) טבעת חיצונית; 2) שני ופלים קוורץ; 3) מכונת כביסה אחת דמוית פלסטיק או נירוסטה; 4) טבעת שמירה; 5) שמן טבילה במיקרוסקופ כחומר איטום (איור 1). הנפח הכולל של פתרון ההתגבשות הנטען על שבב אחד תלוי במטרת הניסוי. ניתן לכוונן את קיבולת תא ההתגבשות על ידי בחירת שים בעוביים שונים ו/או בקוטר פנימי. אנו מקימים באופן שגרתי התקני התגבשות בקיבולת של 10-20 μL באמצעות שימסים בעובי של 50-100 מיקרומטר. מכשיר טיפוסי יכול לייצר עשרות עד אלפי גבישי חלבון המתאימים לאיסוף נתונים סדרתי (איור 2).

כאשר היא תצליח, התגבשות על השבב תייצר עשרות עד מאות ואף אלפי גבישי חלבון בכל מכשיר קוורץ המוכנים לעקיפת קרני רנטגן. בקו קרן סינכרוטרון, מכשיר כזה מותקן על שלב תרגום תלת-צירי של הדיפרקטומטר באמצעות מנגנון קינמטי. חלון ההתגבשות של התקן מותקן נסרק אופטית ומצולם בעשרות עד מאות מיקרוגרפים. מיקרוגרפים אלה נתפרים לאחר מכן למונטאז’ ברזולוציה גבוהה. עבור גבישים רגישים לאור, סריקה אופטית יכולה להתבצע תחת אור אינפרא אדום (IR) כדי למנוע פוטו-אקטיבציה לא מכוונת. תוכנת ראייה ממוחשבת פותחה לזיהוי ואיתור גבישי חלבון המפוזרים באופן אקראי במכשיר. גבישים אלה מדורגים לאחר מכן לפי גודלם, צורתם ומיקומם כדי ליידע או להנחות את אסטרטגיית איסוף הנתונים בקריסטלוגרפיה סדרתית. לדוגמה, ניתן למקם יריות בודדות או מרובות על כל גביש ממוקד. משתמשים יכולים לתכנן מעבר יחיד או מסלולים מרובים דרך גבישים ממוקדים. יישמנו תוכנה לחישוב מסלולי נסיעה שונים. לדוגמה, המסלול הקצר ביותר מחושב באמצעות אלגוריתמים המטפלים בבעיית איש המכירות הנוסע¹³. עבור יישומים קריסטלוגרפיים דינמיים של בדיקת משאבה, ניתן לבחור את התזמון והמשך של צילומי לייזר (משאבה) ורנטגן (בדיקה). איסוף נתונים סדרתי אוטומטי מתוכנת לבצע טרנסלוקציה של כל גביש ממוקד לקרן הרנטגן בזה אחר זה.

הרכיבים העיקריים של דיפרקטומטר insituX כוללים: 1) מחזיק מכשיר; 2) שלב תרגום בעל שלושה צירים; 3) מקור אור לסריקה אופטית; 4) עצירת קרן רנטגן; 5) לשאוב לייזרים אם חלבונים רגישים לאור נחקרים; 6) מיקרו-מחשב Raspberry Pi המצויד במצלמה רגישה ל-IR; 7) בקרת תוכנה לסנכרון מנועים, מצלמה, מקורות אור, לייזר משאבה, ולהתממשק עם פקדי beamline.