Cristallisation sur puce et diffraction série à grande échelle à température ambiante

En raison des effets ionisants des rayons X, la cristallographie des protéines, dans une large mesure, a été limitée aux conditions cryogéniques au cours des trois dernières décennies. Par conséquent, les connaissances actuelles sur les mouvements des protéines au cours de leur fonction découlent en grande partie de comparaisons entre des structures statiques observées dans différents états dans des conditions cryogéniques. Cependant, les températures cryogéniques entravent inévitablement la progression d’une réaction biochimique ou d’une interconversion entre différents états conformationnels pendant que les molécules de protéines sont à l’œuvre. Pour observer directement la dynamique structurale des protéines à la résolution atomique par cristallographie, des méthodes robustes et de routine sont nécessaires pour mener des expériences de diffraction à température ambiante, ce qui nécessite des innovations techniques dans la livraison d’échantillons, la collecte de données et l’analyse de données postérieures. À cette fin, les progrès récents de la cristallographie en série ont ouvert de nouvelles voies pour capturer les images moléculaires d’espèces intermédiaires et structurales à vie courte à température ambiante ^1,2,3. Contrairement à la stratégie « un cristal, un ensemble de données » largement utilisée en cryocristallographie conventionnelle, la cristallographie en série adopte une stratégie de collecte de données similaire à celle de la cryo-microscopie électronique à une particule. Plus précisément, les données expérimentales en cristallographie en série sont collectées en petites fractions à partir d’un grand nombre d’échantillons individuels, suivies d’un traitement intensif des données dans lequel les fractions de données sont évaluées et combinées en un ensemble de données complet pour la détermination de la structure 3D⁴. Cette stratégie « un cristal, un coup » atténue efficacement les dommages causés par les rayons X aux cristaux de protéines à température ambiante via une stratégie de diffraction avant destruction⁵.

Étant donné que la cristallographie en série nécessite un grand nombre de cristaux de protéines pour compléter un ensemble de données, elle pose des défis techniques majeurs pour de nombreux systèmes biologiques où les échantillons de protéines sont limités et / ou la manipulation délicate des cristaux est impliquée. Une autre considération importante est la meilleure façon de préserver l’intégrité des cristaux dans les expériences de diffraction en série. Les méthodes de diffraction in situ répondent à ces préoccupations en permettant aux cristaux de protéines de se diffracter directement de l’endroit où ils se développent sans briser le sceau de la chambre de cristallisation 6,7,8,9. Ces méthodes sans manipulation sont naturellement compatibles avec la diffraction série à grande échelle. Nous avons récemment annoncé la conception et la mise en œuvre d’un dispositif de cristallisation pour la diffraction in situ basé sur un concept cristal sur cristal – cristaux de protéines cultivés directement sur quartz monocristallin¹¹. Cet appareil « cristal sur cristal » offre plusieurs avantages. Tout d’abord, il dispose d’une fenêtre transparente aux rayons X et à la lumière faite d’un substrat de quartz monocristallin, qui produit peu de diffusion de fond, ce qui se traduit par d’excellents rapports signal sur bruit dans les images de diffraction à partir de cristaux de protéines. Deuxièmement, le quartz monocristallin est un excellent pare-vapeur équivalent au verre, fournissant ainsi un environnement stable pour la cristallisation des protéines. En revanche, d’autres dispositifs de cristallisation utilisant des substrats à base de polymères sont sujets au séchage en raison de la perméabilité à la vapeur, sauf si le matériau polymère a une épaisseur substantielle, ce qui contribue par conséquent à une diffusion de fond élevée¹⁰. Troisièmement, ce dispositif permet l’administration d’un grand nombre de cristaux de protéines au faisceau de rayons X sans aucune forme de manipulation ou de récolte des cristaux, ce qui est essentiel pour préserver l’intégrité des cristaux¹¹.

Pour rationaliser les expériences de diffraction des rayons X en série à l’aide des dispositifs cristal sur cristal, nous avons développé un prototype de diffractomètre pour faciliter la commutation entre les modes de balayage optique et de diffraction des rayons X¹². Ce diffractomètre a un faible encombrement et a été utilisé pour la collecte de données en série sur deux lignes de faisceau de la source avancée de photons (APS) au laboratoire national d’Argonne. Plus précisément, nous avons utilisé BioCARS 14-ID-B pour la diffraction Laue et LS-CAT 21-ID-D pour l’oscillation monochromatique. Ce diffractomètre n’est pas nécessaire si un synchrotron ou une ligne de faisceau laser à rayons X à électrons libres est équipé de deux capacités clés : (1) positionnement d’échantillon motorisé avec une plage de course de ±12 mm autour du faisceau de rayons X dans toutes les directions; et (2) un appareil photo numérique sur axe pour l’observation des cristaux sous éclairage lumineux qui est sans danger pour les cristaux de protéines à l’étude. Le dispositif à quartz monocristallin ainsi qu’un diffractomètre portable et le logiciel de contrôle pour le balayage optique, la reconnaissance cristalline et la collecte automatisée de données in situ constituent collectivement la plate-forme inSituX pour la cristallographie en série. Bien que ce développement soit principalement motivé par ses applications de cristallographie dynamique utilisant une source de rayons X polychromatique, nous avons démontré le potentiel de cette technologie pour soutenir les méthodes d’oscillation monochromatique^10,12. Grâce à l’automatisation, cette plate-forme offre une méthode de collecte de données en série à haut débit à température ambiante avec une consommation de protéines abordable.

Dans cette contribution, nous décrivons en détail comment mettre en place la cristallisation sur puce dans un laboratoire humide et comment effectuer la collecte de données de rayons X en série sur une ligne de faisceau synchrotron à l’aide de la plate-forme inSituX.

La méthode par lots est utilisée pour mettre en place la cristallisation sur puce dans des conditions similaires à celles de la méthode de diffusion de vapeur obtenue pour le même échantillon de protéines (tableau 1). Comme point de départ, nous recommandons d’utiliser un précipitant à une concentration de 1,2 à 1,5 fois celle de la méthode de diffusion de vapeur. Si nécessaire, les conditions de cristallisation des lots peuvent être optimisées davantage grâce à un criblage fin par grille. Les plaquettes de quartz ne sont pas nécessaires pour les essais d’optimisation; Les lamelles de couverture en verre peuvent être utilisées à la place (voir ci-dessous). Les dispositifs de cristallisation partiellement chargés sont recommandés pour conserver les essais d’optimisation à plus petite échelle. Un certain nombre d’échantillons de protéines ont été cristallisés avec succès sur de tels dispositifs en utilisant la méthode par lots¹⁰ (tableau 1).

Le dispositif lui-même se compose des parties suivantes: 1) une bague extérieure; 2) deux plaquettes de quartz; 3) une cale en forme de rondelle en plastique ou en acier inoxydable; 4) un anneau de retenue; 5) l’huile d’immersion pour microscope comme scellant (figure 1). Le volume total de la solution de cristallisation chargée sur une puce dépend du but de l’expérience. La capacité de la chambre de cristallisation peut être ajustée en choisissant une cale de différentes épaisseurs et/ou diamètres intérieurs. Nous mettons régulièrement en place des dispositifs de cristallisation d’une capacité de 10 à 20 μL à l’aide de cales de 50 à 100 μm d’épaisseur. Un dispositif typique peut produire des dizaines à des milliers de cristaux de protéines adéquats pour la collecte de données en série (Figure 2).

En cas de succès, la cristallisation sur puce produira des dizaines, voire des centaines, voire des milliers de cristaux de protéines sur chaque dispositif à quartz prêt pour la diffraction des rayons X. Sur une ligne de faisceau synchrotron, un tel dispositif est monté sur un étage de translation à trois axes du diffractomètre à l’aide d’un mécanisme cinématique. La fenêtre de cristallisation d’un dispositif monté est balayée optiquement et imagée dans des dizaines à des centaines de micrographies. Ces micrographies sont ensuite assemblées dans un montage haute résolution. Pour les cristaux photosensibles, le balayage optique peut être effectué sous lumière infrarouge (IR) pour éviter une photoactivation involontaire. Un logiciel de vision par ordinateur a été développé pour identifier et localiser les cristaux de protéines distribués au hasard sur l’appareil. Ces cristaux sont ensuite classés en fonction de leur taille, de leur forme et de leur position pour informer ou guider la stratégie de collecte de données en cristallographie sérielle. Par exemple, des tirs uniques ou multiples peuvent être localisés sur chaque cristal ciblé. Les utilisateurs pouvaient planifier un seul passage ou plusieurs itinéraires à travers des cristaux ciblés. Nous avons mis en place un logiciel pour calculer différents itinéraires de voyage. Par exemple, l’itinéraire le plus court est calculé à l’aide d’algorithmes qui résolvent le problème du vendeur itinérant¹³. Pour les applications cristallographiques dynamiques pompe-sonde, le moment et la durée des tirs laser (pompe) et à rayons X (sonde) peuvent être choisis. Une collecte automatisée de données en série est programmée pour transférer chaque cristal ciblé dans le faisceau de rayons X l’un après l’autre.

Les composants clés du diffractomètre insituX comprennent: 1) un support de dispositif; 2) une étape de traduction à trois axes; 3) une source lumineuse pour le balayage optique; 4) un arrêt de faisceau de rayons X; 5) pomper des lasers si des protéines photosensibles sont étudiées; 6) Micro-ordinateur Raspberry Pi équipé d’une caméra sensible aux infrarouges; 7) Logiciel de contrôle pour synchroniser les moteurs, la caméra, les sources lumineuses, le laser de la pompe et pour l’interface avec les commandes de ligne de faisceau.