التبلور على الرقاقة والحيود التسلسلي واسع النطاق في درجة حرارة الغرفة
Summary
تصف هذه المساهمة كيفية إعداد بلورة البروتين على أجهزة الكريستال على الكريستال وكيفية إجراء جمع البيانات التسلسلية الآلية في درجة حرارة الغرفة باستخدام منصة التبلور على الرقاقة.
Abstract
يمكن فهم التفاعلات الكيميائية الحيوية والعمليات البيولوجية بشكل أفضل من خلال توضيح كيفية انتقال البروتينات بين حالاتها الوظيفية. نظرا لأن درجات الحرارة المبردة غير فسيولوجية وقد تمنع أو تردع أو حتى تغير ديناميكيات بنية البروتين ، فإن الطريقة القوية لتجارب حيود الأشعة السينية الروتينية في درجة حرارة الغرفة أمر مرغوب فيه للغاية. تم تصميم جهاز الكريستال على البلورة والأجهزة والبرامج المصاحبة له المستخدمة في هذا البروتوكول لتمكين حيود الأشعة السينية في الموقع في درجة حرارة الغرفة لبلورات البروتين ذات الأحجام المختلفة دون أي معالجة للعينات. نقدم هنا بروتوكولات الخطوات الرئيسية من تجميع الجهاز ، والتبلور على الرقاقة ، والمسح الضوئي ، والتعرف على الكريستال إلى تخطيط لقطات الأشعة السينية وجمع البيانات الآلي. نظرا لأن هذه المنصة لا تتطلب حصادا بلوريا أو أي معالجة أخرى للعينات ، يمكن إدخال مئات إلى آلاف بلورات البروتين المزروعة على الرقاقة في حزمة الأشعة السينية بطريقة قابلة للبرمجة وعالية الإنتاجية.
Introduction
بسبب التأثيرات المؤينة للإشعاع بالأشعة السينية ، اقتصر علم البلورات البروتيني ، إلى حد كبير ، على الظروف المبردة في العقود الثلاثة الماضية. لذلك ، فإن المعرفة الحالية لحركات البروتين أثناء وظيفتها تنشأ إلى حد كبير من المقارنات بين الهياكل الثابتة التي لوحظت في حالات مختلفة في ظل ظروف مبردة. ومع ذلك ، فإن درجات الحرارة المبردة تعيق حتما تطور التفاعل الكيميائي الحيوي أو التحويل بين الحالات التوافقية المختلفة أثناء عمل جزيئات البروتين. لمراقبة ديناميكيات بنية البروتين مباشرة عند الدقة الذرية عن طريق علم البلورات ، هناك حاجة إلى طرق قوية وروتينية لإجراء تجارب الحيود في درجة حرارة الغرفة ، الأمر الذي يتطلب ابتكارات تقنية في تسليم العينات وجمع البيانات وتحليل البيانات الخلفية. تحقيقا لهذه الغاية ، قدمت التطورات الحديثة في علم البلورات التسلسلي طرقا جديدة لالتقاط الصور الجزيئية للأنواع الهيكلية الوسيطة وقصيرة العمر في درجة حرارة الغرفة1،2،3. على النقيض من استراتيجية “مجموعة بيانات بلورة واحدة” المستخدمة على نطاق واسع في علم البلورات بالتبريد التقليدي ، يعتمد علم البلورات التسلسلي استراتيجية لجمع البيانات مماثلة لتلك الخاصة بالمجهر الإلكتروني بالتبريد أحادي الجسيم. على وجه التحديد ، يتم جمع البيانات التجريبية في علم البلورات التسلسلي في أجزاء صغيرة من عدد كبير من العينات الفردية ، تليها معالجة البيانات المكثفة التي يتم فيها تقييم كسور البيانات ودمجها في مجموعة بيانات كاملة لتحديد بنية 3D4. تخفف استراتيجية “البلورة الواحدة والطلقة الواحدة” بشكل فعال من تلف الأشعة السينية لبلورات البروتين في درجة حرارة الغرفة عبر استراتيجية الحيود قبل التدمير5.
نظرا لأن علم البلورات التسلسلي يتطلب عددا كبيرا من بلورات البروتين لإكمال مجموعة البيانات ، فإنه يطرح تحديات تقنية كبيرة للعديد من الأنظمة البيولوجية حيث تكون عينات البروتين محدودة و / أو تنطوي على معالجة بلورية دقيقة. هناك اعتبار مهم آخر وهو أفضل طريقة للحفاظ على سلامة البلورات في تجارب الحيود التسلسلي. تعالج طرق الحيود في الموقع هذه المخاوف من خلال السماح لبلورات البروتين بالحيود مباشرة من مكان نموها دون كسر ختم غرفة التبلور6،7،8،9. تتوافق هذه الطرق الخالية من المناولة بشكل طبيعي مع الحيود التسلسلي واسع النطاق. لقد أبلغنا مؤخرا عن تصميم وتنفيذ جهاز تبلور للحيود في الموقع بناء على مفهوم بلورة على بلورة – بلورات بروتينية تنمو مباشرة على الكوارتز أحادي البلورية11. يوفر هذا الجهاز “الكريستال على الكريستال” العديد من المزايا. أولا ، يتميز بالأشعة السينية ونافذة شفافة خفيفة مصنوعة من ركيزة كوارتز أحادية البلورية ، والتي تنتج القليل من تشتت الخلفية ، مما يؤدي إلى نسب إشارة إلى ضوضاء ممتازة في صور الحيود من بلورات البروتين. ثانيا ، الكوارتز أحادي البلورة هو حاجز بخار ممتاز مكافئ للزجاج ، وبالتالي يوفر بيئة مستقرة لتبلور البروتين. في المقابل ، تكون أجهزة التبلور الأخرى التي تستخدم ركائز قائمة على البوليمر عرضة للتجفيف بسبب نفاذية البخار ما لم يكن لمادة البوليمر سمك كبير ، مما يساهم بالتالي في تشتت الخلفية العالية10. ثالثا ، يتيح هذا الجهاز توصيل عدد كبير من بلورات البروتين إلى حزمة الأشعة السينية دون أي شكل من أشكال التلاعب بالبلورات أو حصادها ، وهو أمر بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة البلورات11.
لتبسيط تجارب حيود الأشعة السينية التسلسلية باستخدام أجهزة الكريستال على الكريستال ، قمنا بتطوير نموذج أولي لمقياس الحيود لتسهيل التبديل السهل بين المسح الضوئي ووسائط حيود الأشعة السينية12. مقياس الحيود هذا له بصمة صغيرة وقد تم استخدامه لجمع البيانات التسلسلية في خطين شعاعيين لمصدر الفوتون المتقدم (APS) في مختبر أرغون الوطني. على وجه التحديد ، استخدمنا BioCARS 14-ID-B لحيود Laue و LS-CAT 21-ID-D للتذبذب أحادي اللون. جهاز مقياس الحيود هذا غير مطلوب إذا كان خط شعاع ليزر السنكروترون أو الأشعة السينية الإلكترون الحر مزودا بقدرتين رئيسيتين: (1) تحديد موضع العينة الآلية مع نطاق سفر يبلغ ±12 مم حول حزمة الأشعة السينية في جميع الاتجاهات. و (2) كاميرا رقمية على المحور لمشاهدة الكريستال تحت إضاءة الضوء آمنة لبلورات البروتين قيد الدراسة. يشكل جهاز الكوارتز أحادي البلورية جنبا إلى جنب مع مقياس الحيود المحمول وبرنامج التحكم للمسح البصري والتعرف على الكريستال وجمع البيانات الآلي في الموقع بشكل جماعي منصة inSituX لعلم البلورات التسلسلي. على الرغم من أن هذا التطور مدفوع في المقام الأول بتطبيقات علم البلورات الديناميكية باستخدام مصدر أشعة سينية متعدد الألوان ، فقد أثبتنا إمكانات هذه التقنية لدعم طرق التذبذب أحادية اللون10,12. مع الأتمتة ، توفر هذه المنصة طريقة جمع بيانات تسلسلية عالية الإنتاجية في درجة حرارة الغرفة مع استهلاك بروتين ميسور التكلفة.
في هذه المساهمة ، نصف بالتفصيل كيفية إعداد التبلور على الرقاقة في مختبر رطب وكيفية إجراء جمع بيانات الأشعة السينية التسلسلية على خط شعاع السنكروترون باستخدام منصة inSituX.
تستخدم طريقة الدفعات لإعداد التبلور على الرقاقة في ظل ظروف مماثلة لطريقة نشر البخار التي تم الحصول عليها لنفس عينة البروتين (الجدول 1). كنقطة بداية، نوصي باستخدام المرسب بتركيز 1.2-1.5x لطريقة انتشار البخار. إذا لزم الأمر ، يمكن تحسين حالة تبلور الدفعات بشكل أكبر عن طريق فحص الشبكة الدقيقة. رقائق الكوارتز ليست ضرورية لتجارب التحسين ؛ يمكن استخدام أغطية الزجاج بدلا من ذلك (انظر أدناه). يوصى باستخدام أجهزة التبلور المحملة جزئيا للحفاظ على تجارب التحسين على نطاق أصغر. تم تبلور عدد من عينات البروتين بنجاح على هذه الأجهزة باستخدام طريقة الدفعات10 (الجدول 1).
يتكون الجهاز نفسه من الأجزاء التالية: 1) حلقة خارجية. 2) اثنين من رقائق الكوارتز. 3) رقاقة واحدة تشبه غسالة من البلاستيك أو الفولاذ المقاوم للصدأ ؛ 4) حلقة الاحتفاظ ؛ 5) زيت الغمر المجهري كمادة مانعة للتسرب (الشكل 1). يعتمد الحجم الكلي لمحلول التبلور المحمل على شريحة واحدة على الغرض من التجربة. يمكن تعديل سعة غرفة التبلور عن طريق اختيار رقاقة بسماكات مختلفة و / أو قطر داخلي. نقوم بشكل روتيني بإعداد أجهزة تبلور بسعة 10-20 ميكرولتر باستخدام حشوات بسمك 50-100 ميكرومتر. يمكن لجهاز نموذجي إنتاج عشرات إلى آلاف بلورات البروتين الكافية لجمع البيانات التسلسلية (الشكل 2).
عند نجاحها ، ستنتج التبلور على الرقاقة عشرات إلى مئات أو حتى آلاف بلورات البروتين على كل جهاز كوارتز جاهز لحيود الأشعة السينية. عند خط شعاع السنكروترون ، يتم تثبيت هذا الجهاز على مرحلة ترجمة ثلاثية المحاور لمقياس الحيود باستخدام آلية حركية. يتم مسح نافذة التبلور لجهاز مثبت بصريا وتصويرها في عشرات إلى مئات الصور المجهرية. ثم يتم خياطة هذه الصور المجهرية في مونتاج عالي الدقة. بالنسبة للبلورات الحساسة للضوء ، يمكن إجراء المسح الضوئي تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء (IR) لتجنب التنشيط الضوئي غير المقصود. تم تطوير برنامج رؤية الكمبيوتر لتحديد وتحديد بلورات البروتين الموزعة عشوائيا على الجهاز. ثم يتم تصنيف هذه البلورات وفقا لحجمها وشكلها وموقعها لإعلام أو توجيه استراتيجية جمع البيانات في علم البلورات التسلسلي. على سبيل المثال ، يمكن وضع لقطات مفردة أو متعددة على كل بلورة مستهدفة. يمكن للمستخدمين التخطيط لمسار واحد أو طرق متعددة من خلال البلورات المستهدفة. لقد قمنا بتنفيذ برنامج لحساب طرق السفر المختلفة. على سبيل المثال ، يتم حساب أقصر طريق باستخدام الخوارزميات التي تعالج مشكلة البائع المتجول13. بالنسبة للتطبيقات البلورية الديناميكية لمسبار المضخة ، يمكن اختيار توقيت ومدة لقطات الليزر (المضخة) والأشعة السينية (المسبار). تتم برمجة جمع البيانات التسلسلية الآلية لنقل كل بلورة مستهدفة إلى حزمة الأشعة السينية واحدة تلو الأخرى.
تشمل المكونات الرئيسية لمقياس حيود insituX ما يلي: 1) حامل الجهاز. 2) مرحلة ترجمة ثلاثية المحاور ؛ 3) مصدر ضوء للمسح البصري ؛ 4) توقف شعاع الأشعة السينية. 5) ضخ الليزر إذا تمت دراسة البروتينات الحساسة للضوء ؛ 6) الحواسيب الصغيرة Raspberry Pi مجهزة بكاميرا حساسة للأشعة تحت الحمراء ؛ 7) برنامج التحكم لمزامنة المحركات والكاميرا ومصادر الضوء ومضخة الليزر والتفاعل مع عناصر التحكم في خط الشعاع.
Protocol
Representative Results
Discussion
واجه علم بلورات البروتين في السنوات الأولى الذي تم إجراؤه في درجة حرارة الغرفة صعوبة هائلة في مكافحة أضرار الأشعة السينية. وبالتالي ، فقد تم استبداله بطريقة البلورات بالتبريد الأكثر قوة حيث أصبحت مصادر الأشعة السينية السنكروترونية متاحة بسهولة20. مع ظهور ليزر الإلكترون الحر …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم استخدام مصدر الفوتون المتقدم ، وهو مرفق مستخدم تابع لمكتب العلوم يديره مختبر أرجون الوطني لوزارة الطاقة الأمريكية ، بموجب العقد DE-AC02-06CH11357. تم دعم استخدام BioCARS من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب المنحة رقم R24GM111072. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم دعم استخدام قطاع LS-CAT 21 من قبل مؤسسة ميشيغان للتنمية الاقتصادية ومنحة Michigan Technology Tri-Corridor 085P1000817. يتم دعم هذا العمل من خلال منح من جامعة إلينوي في شيكاغو ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01EY024363) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (MCB 2017274) إلى XY.
Materials
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Brändén, G., Neutze, R. Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography. Science. 373, (2021).
- Fischer, M. Macromolecular room temperature crystallography. Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).
- Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).
- Nogales, E., Scheres, S. H. W. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).
- Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N. Diffraction before destruction. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 369, 20130313 (2014).
- Kisselman, G., et al. X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).
- Liang, M., et al. Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).
- Perry, S. L., et al. In situ serial Laue diffraction on a microfluidic crystallization device. Journal of Applied Crystallography. 47, 1975-1982 (2014).
- Ren, Z., et al. Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature. Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).
- Ren, Z. Single crystal quartz chips for protein crystallization and X-ray diffraction data collection and related methods. US patent. , (2017).
- Ren, Z., et al. An automated platform for in situ serial crystallography at room temperature. IUCrJ. 7, 1009-1018 (2020).
- Croes, G. A. A method for solving traveling salesman problems. Operations Research. 6, 791-812 (1958).
- Bandara, S., et al. Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118 (2021).
- Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).
- Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome. Nature. 479, 428-432 (2011).
- Zhang, F., Scheerer, P., Oberpichler, I., Lamparter, T., Krauss, N. Crystal structure of a prokaryotic (6-4) photolyase with an Fe-S cluster and a 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine antenna chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 7217-7222 (2013).
- Zeng, X., et al. Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8. Nature Plants. 1, 14006 (2015).
- Wang, M., et al. Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex. 生物化学. 50, 581-590 (2011).
- Rodgrs, D. W. Cryocrystallography. Structure. 2, 1135-1140 (1994).
- Zhao, F. -. Z., et al. A guide to sample delivery systems for serial crystallography. TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).
