Гиппокамп был впервые описан болонским анатомом Джулио Чезаре Аранцио в 1500-х годах¹. Называя эту новообретенную структуру, Аранцио, вероятно, был вдохновлен ее странным сходством с морским коньком рода Hippocampus¹. Гиппокамп участвует в стрессовых реакциях, но широко известен своей ролью в обучении и памяти. Более конкретно, гиппокамп отвечает за кодирование и извлечение декларативной и пространственной памяти¹.

Гиппокамп, или собственно гиппокамп, делится на подполя CA1 (cornu ammonis), CA2 и CA3¹. По сравнению с остальной нервной системой, гиппокамп имеет несколько уникальных определяющих характеристик, включая его пластичность и потенциал для продолжающегося нейрогенеза². Нейрогенез – это процесс пролиферации и дифференцировки нервных стволовых клеток с последующей их интеграцией в уже существующую нейронную сеть. Нейрогенез ограничен субгранулярной зоной зубчатой извилины и субвентрикулярной зоной боковых желудочков (и обонятельных луковиц)³. В то время как нейрогенез в изобилии присутствует в эмбриогенезе, это пожизненный процесс ^3,4. Таким образом, эта дискуссия будет сосредоточена на взрослом нейрогенезе в гиппокампе.

Субвентрикулярная и субгранулярная зоны представляют собой нейрогенные ниши, содержащие эпендимальные и сосудистые клетки, а также незрелые и зрелые линии нервных стволовых клеток⁵. Микроглия вносит свой вклад в эти ниши в качестве иммунных клеток для регулирования нейрогенеза⁶. Нейронные клетки-предшественники являются нестемочными клетками-потомками нервных стволовых клеток⁷. В субвентрикулярной зоне присутствуют три типа нейронных предшественников: радиальные глиоподобные клетки типа В, транзитоусиливающие предшественники типа С и нейробласты типа А ^3,8. Медленно делящиеся нейронные клетки-предшественники типа В в субвентрикулярной зоне могут дифференцироваться в быстро делящиеся клетки типа С⁸. Впоследствии клетки типа С дифференцируются в клетки типа А⁸. Эти нейробласты мигрируют через ростральный миграционный поток к обонятельной луковице, прежде чем дифференцироваться в интернейроны или олигодендроциты⁹. Эти интернейроны обонятельных луковиц являются ключом к обонятельной кратковременной памяти и ассоциативному обучению, тогда как олигодендроциты миелинизируют аксоны мозолистого тела⁹. Большая часть взрослого нейрогенеза происходит в подгранулевой зоне зубчатой извилины, где находятся радиальные нейронные предшественники типа 1 и нерадиальные нейронные предшественники типа^2. Большинству нейронных клеток-предшественников суждено стать зубчатыми гранулярными нейронами и астроцитами¹⁰. Соединенные щелевыми соединениями, астроциты образуют сети для модуляции пластичности, синаптической активности и возбудимости нейронов⁵. В качестве первичного возбуждающего нейрона зубчатой извилины гранулярные клетки обеспечивают вход из энторинальной коры в область CA3¹¹.

Популяции нервных стволовых клеток могут быть выделены с использованием иммуномагнитных или иммунофлуоресцентных стратегий изоляции^12,13. Нервную ткань особенно трудно диссоциировать; попытки сделать это часто приводят к тому, что образцы с плохой жизнеспособностью клеток и/или не получают необходимой одноклеточной суспензии для последующего анализа. Нейронная диссоциация может проводиться с помощью механической диссоциации (например, с использованием фильтров, методов измельчения или тритурации пипетки), ферментативного пищеварения или комбинации методов^14,15. В исследовании, оценивающем методы нейронной диссоциации, жизнеспособность и качество ручной механической диссоциации путем тритурации пипетки по сравнению с комбинациями тритурации пипетки и пищеварения с различными ферментами сравнивались¹⁵. Качество оценивали на основе количества клеточных сгустков и ДНК или субклеточного мусора в подготовленной суспензии¹⁵. Суспензии глиальных опухолей, подвергшихся только ручной механической диссоциации, имели значительно более низкую жизнеспособность клеток, чем лечение диспазой или комбинацией ДНКазы, коллагеназы и гиалуронидазы¹⁵. Volovitz et al. признали различия в жизнеспособности и качестве между различными методами и подчеркнули, что неадекватная диссоциация может снизить точность последующего анализа¹⁵.

В отдельном исследовании авторы сравнили более 60 различных методов и комбинаций диссоциации культивируемых нейрональных клеток¹⁴. Эти методы включали восемь различных вариаций ручной механической диссоциации путем тритурации пипетки, сравнение инкубации с пятью отдельными ферментами через три различных интервала и различные комбинации механической диссоциации с ферментативным пищеварением или комбинацией двух ферментов¹⁴. Ни один из механических способов не дал одноэлементной суспензии¹⁴. Четыре из одного ферментного лечения, десять комбинированных ферментативных методов лечения и четыре комбинации механической диссоциации с ферментативным пищеварением дали одноклеточную суспензию¹⁴. Ферментативное сбраживание с TrypLE с последующим трипсином-ЭДТА наиболее эффективно диссоциировало образцы¹⁴. Кстати, образцы, обработанные TrypLE и/или Trypsin-EDTA, имели тенденцию образовывать желатиновые сгустки¹⁴. Хотя это исследование было проведено на культивируемых клетках, оно говорит о недостатках тритурации пипетки или ферментативного пищеварения.

Параллельные сравнения ручной и автоматизированной механической диссоциации отсутствуют. Тем не менее, одна группа провела проточную цитометрию для сравнения ручной и полуавтоматической механической диссоциации всего мозга мыши в сочетании с коммерческими наборами ферментативной диссоциации папаина или трипсина¹⁶. Обработка диссоциатором более последовательно давала жизнеспособные клетки¹⁶. После диссоциации авторы также выделили клетки Проминина-1, нейрональные клетки-предшественники и микроглию¹⁶. Для двух из трех изолированных клеточных популяций чистота изолированных клеток была немного выше, когда образцы обрабатывали диссоциатором, по сравнению с вручную¹⁶. Reiß et al. отметили, что вариабельность от человека к человеку в методе пипетирования препятствует воспроизводимости жизнеспособного выхода клеточной популяции при диссоциации^{тканей 16}. Авторы пришли к выводу, что автоматизированная механическая диссоциация стандартизирует обработку образцов¹⁶.

Метод диссоциации, описанный в этой рукописи, представляет собой комбинацию полностью автоматизированной механической диссоциации и ферментативного пищеварения с использованием растворов, сопровождающих коммерческий набор для диссоциации мозга взрослого человека¹⁷. В отличие от стандартных протоколов, этот оптимизированный протокол уменьшает манипуляции с образцами, дает очень жизнеспособную одноклеточную суспензию и предназначен для обработки минимальных количеств исходной ткани.