Monitoreo en tiempo real de la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citoquinas

El correcto desarrollo y función de las células T son esenciales para la capacidad del sistema inmunitario de reconocer y responder a los antígenos. La fosforilación oxidativa mitocondrial (OxPhos) cambia según el estado de la célula T. Las células T naïve utilizan predominantemente OxPhos para producir ATP, mientras que las células T activadas experimentan una transición metabólica donde la glucólisis se vuelve ^dominante1. Después de la fase efectora, el pequeño subconjunto restante de células T de memoria vuelve a un estado metabólico dominado por ^OxPhos2,3. Los cambios de OxPhos siguen la diferenciación de las células T a tal grado que incluso subconjuntos de células T pueden diferenciarse por sus propiedades específicas de ^OxPhos1. Por el contrario, OxPhos es importante para la función de las células T, y se ha demostrado que la inhibición de OxPhos bloquea la proliferación y la producción de citoquinas de las células ^T4. Por lo tanto, la capacidad de cuantificar las propiedades de oxPhos de células T de una manera precisa y reproducible es una herramienta poderosa para cualquier persona que trabaje con células T.

En este protocolo, las propiedades de oxPhos de células T se miden utilizando un analizador de flujo extracelular. La función principal de este analizador es medir continuamente el contenido de oxígeno de los medios de crecimiento de las células a analizar. Se supone que el oxígeno eliminado de los medios de crecimiento es absorbido por las células. Al tratar las células con una variedad de inhibidores o modificadores de OxPhos, una caída en la absorción de oxígeno se asocia con la función inhibida o modulada. Por ejemplo, la inhibición de la ATP sintasa conducirá a una absorción celular reducida de oxígeno que de otro modo se utilizaría para producir ATP por fosforilación oxidativa. Otros equipos, incluidos el electrodo Clark y el instrumento Oroboros, ofrecen una funcionalidad similar, y cada instrumento tiene diferentes ventajas y deficiencias. Se puede utilizar una amplia gama de tipos de células para estudios en estos dispositivos, pero un tipo de célula particularmente desafiante son los linfocitos T primarios ^humanos5. Debido a su pequeño tamaño, pobre supervivencia ex vivo y propiedades no adherentes, las células T primarias humanas pueden ser difíciles de estudiar.

Este es un protocolo para estudiar la respiración mitocondrial de las células T primarias humanas mediante un analizador extracelular. El protocolo se divide en una ejecución de optimización, donde se determinan las concentraciones óptimas de número de células por pozo, así como la concentración óptima de oligomicina y FCCP. Además, se ejecuta un ensayo, donde se utilizan las condiciones optimizadas.

Utilizando PBMC humanos derivados de la sangre y cultivos de células T primarias ex vivo , este protocolo demuestra la importancia de una concentración óptima de inhibidores y la relevancia de usar una inyección separada en lugar de una inyección secuencial de inhibidores mitocondriales cuando se trabaja con tipos de células sensibles. Finalmente, está demostrado que este ensayo puede detectar de manera robusta diferencias sutiles en la respiración mitocondrial tras la polarización con las citoquinas IL-2 e IL-15.