サイトカイン分化型ヒト初代T細胞におけるミトコンドリア呼吸のリアルタイムモニタリング

正しいT細胞の発生と機能は、免疫系が抗原を認識して応答する能力に不可欠です。ミトコンドリア酸化リン酸化(OxPhos)は、T細胞の状態に応じて変化する。ナイーブT細胞は主にATPを生成するためにOxPhosを使用しますが、活性化T細胞は解糖系が優勢になる代謝遷移を経験します¹。エフェクター期の後、メモリーT細胞のわずかに残ったサブセットは、OxPhos2,3によって支配される代謝状態に戻る。OxPhosの変化は、T細胞のサブセットでさえも、それらの特異的なOxPhos特性によって分化することができる程度までT細胞の分化に続く¹。逆に、OxPhosはT細胞の機能にとって重要であり、OxPhosの阻害はT細胞の増殖およびサイトカイン産生をブロックすることが実証されている⁴。したがって、T細胞OxPhosの特性を正確かつ再現性のある方法で定量化する能力は、T細胞を扱う人にとって強力なツールです。

このプロトコールでは、T細胞OxPhosの特性は、細胞外フラックス分析装置を用いて測定される。この分析装置のコア機能は、分析対象の細胞の増殖培地中の酸素含有量を連続的に測定することである。増殖培地から除去された酸素は、細胞によって取り込まれると仮定される。細胞を様々なOxPhos阻害剤または修飾剤で処理することによって、酸素取り込みの低下が阻害または調節された機能に関連する。例えば、ATP合成酵素の阻害は、酸化的リン酸化によってATPを生成するために使用されるであろう酸素の細胞取り込みの減少をもたらすであろう。クラーク電極やオロボロス装置を含む他の装置は、同様の機能を提供し、各装置には異なる長所と短所があります。これらの装置では、幅広い細胞型を研究に使用できますが、特に困難な細胞型の1つはヒト初代Tリン^パ球5です。その小さなサイズ、 生体外での生存率の悪さ、および非接着特性のために、ヒト初代T細胞は研究が困難な場合があります。

これは、細胞外分析装置によるヒト初代T細胞のミトコンドリア呼吸を研究するためのプロトコールである。プロトコルは最適化ランに分割され、ウェルあたりの細胞数の最適濃度、ならびにオリゴマイシンおよびFCCPの最適濃度が決定される。さらに、最適化された条件が使用されるアッセイラン。

血液由来のヒトPBMCおよび エキソビボ 初代T細胞培養物を用いて、このプロトコールは、最適な阻害剤濃度の重要性と、感受性細胞型を扱う際にミトコンドリア阻害剤の逐次注射の代わりに別個を使用することの関連性を実証する。最後に、このアッセイがサイトカインIL-2およびIL-15による分極時のミトコンドリア呼吸の微妙な違いを堅牢に検出できることが実証された。