Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

As células fotorreceptoras de rod, bem embaladas na camada mais externa da retina neural, são parte integrante da visão de luz fraca. Para funcionar como contadores de fótons fiéis, as hastes utilizam uma via de sinalização baseada em proteína G, denominada fototransdução, para gerar respostas rápidas, amplificadas e reprodutíveis à captura de fótons únicos. Esta resposta à luz finalmente desencadeia uma mudança na correnteza na membrana plasmática e é posteriormente sinalizada para o resto do sistema ^visual1. Como o nome indica, cada célula de haste tem uma forma distinta semelhante a uma haste e exibe uma morfologia celular altamente polarizada, consistindo de um segmento externo (OS), segmento interno (IS), corpo celular (CB) e terminal sináptico (ST). Cada compartimento subcelular possui máquinas proteicas específicas (ligadas à membrana e solúveis), características biomoleculares e complexos proteicos que desempenham papéis cruciais, como fototransdução visual, limpeza geral e síntese de proteínas, e transmissão sináptica2,3.

Há mais de 30 anos, o movimento recíproco dependente da luz de proteínas subcelulares, especificamente transdutina (longe do SO) e preso (em direção ao SO), foi observado pela primeira vez4,5,6,7. No início, esse fenômeno observado foi recebido com ceticismo, devido, em parte, à vulnerabilidade da imunohistoquímica ao mascaramento de epítope8. No início dos anos 2000, a translocação de proteínas dependentes de estímulos foi confirmada por meio de uma rigorosa e árdua técnica de secção ^física9. A seção tangencial serial da retina de roedores congelados, seguida de imunoblotting, revelou que transducin9,10, prende em ^11,12, e recupera em ¹³ todos passam por redistribuição subcelular em resposta à luz. Acredita-se que a translocação leve dessas proteínas de sinalização chave não só regula a sensibilidade da cascata de fototransdução9,14,15, mas também pode ser neuroprotetora contra danos ^{leves16,17,18}. Como o transporte de proteínas leve em hastes parece ser muito significativo para a biologia celular e fisiologia, técnicas que permitem o isolamento de diferentes compartimentos subcelulares para determinar a distribuição de proteínas são ferramentas valiosas de pesquisa.

Atualmente, existem alguns métodos que visam isolar os compartimentos subcelulares da haste. No entanto, esses métodos podem ser longos e difíceis de reproduzir, ou requerem uma quantidade considerável de isolamento da retina. As preparações do segmento externo de rod (ROS) através da centrifugação gradiente de ^densidade19, por exemplo, é comumente usada para separar o ROS do homogeneato da retina. Este método é amplamente utilizado para a mancha ocidental, mas o procedimento é muito demorado e requer um mínimo de 8-12 retinas ^murinas20. Por outro lado, a secção tangencial serial da retina congelada de murina e rato foi implementada com sucesso na isolação do SO, IS, CB e ST9,11,13. No entanto, este método é tecnicamente desafiador devido à necessidade de achatar totalmente a pequena e altamente curvada retina murina para alinhar as camadas de retina antes da seção tangencial. Como há uma infinidade de modelos de camundongos e camundongos transgênicos recapitulando doenças do sistema visual, a criação de uma técnica que separa de forma confiável, rápida e fácil os compartimentos individuais de hastes é promissora na revelação dos processos fisiológicos que ocorrem em cada compartimento especializado e dos mecanismos que fundamentam os processos visuais em saúde e doença.

Para facilitar essas investigações, descrevemos dois métodos de descascamento que isolam compartimentos subcelulares de haste mais facilmente do que os protocolos atuais. O primeiro método de peeling, adaptado de uma técnica para expor células bipolares fluorescentes rotuladas para gravação de grampo de ^remendo21, emprega papel filtro de celulose para remover sequencialmente o ROS de uma retina murina viva e isolada (Figura 1). O segundo método, adaptado de um procedimento que isola as três camadas primárias das células da retina de ^{uma retina de 22} e sapo, utiliza fita adesiva para remover o segmento interno de ROS e haste (RIS) de uma retina liofilizada (Figura 2). Ambos os procedimentos podem ser concluídos em 1h e são consideravelmente fáceis de usar. Fornecemos validação da eficácia desses dois protocolos de separação para a mancha ocidental utilizando retinas adaptadas à escuridão e expostas à luz de camundongos C57BL/6J para demonstrar translocação induzida pela luz de transduína de haste (GNAT1) e arrestin (ARR1). Além disso, usando o método de descascamento de fita, fornecemos evidências adicionais de que nossa técnica pode ser usada para examinar e abordar inconsistências entre dados de localização de proteínas adquiridos pela imunocitoquímica (ICC) e manchas ocidentais. Especificamente, nossa técnica mostrou que: 1) a isoforma proteína quinase C-alfa (PKCα) está presente não apenas em células bipolares, mas também em murine ROS e RIS, embora em baixas ^{concentrações24,25}, e 2) rhodopsin quinase (GRK1) está presente predominantemente na amostra isolada do SO. Esses dados demonstram a eficácia de nossas duas técnicas de descascamento para separar e quantificar proteínas específicas de vara e retina.