파지 디스플레이를 사용하여 E3 리개아제용 유비퀴틴 변종 변종 변조기 개발

단백질-단백질 상호 작용의 분자 세부 사항을 이해하는 것은 생물학적 과정의 신호 변환 메커니즘, 특히 임상적으로 중요한 질병에 기여하는 신호를 파기하는 데 중요합니다. 최근 몇 년 동안 파지 디스플레이는 단백질/펩티드를 원하는 표적 단백질^에 훨씬 개선된 결합으로 분리하는 실용적이고 접근 가능한 방법으로 활용되어 ^{왔으며, 이는} 단백질 단백질 상호작용의 세포내 프로브로서 사용될 수 있다.

유비퀴티닝은 유비퀴틴(Ub)을 단백질 기판에 곱하게 결합하여 분해또는 세포 신호 변화를 중재하는 효소 활동(E1 활성화 효소 → E2 컨쥬게이팅 효소 → E3 리게아제)의 폭포입니다. 또한, deubiquitinases 단백질에서 유비퀴틴의 제거를 촉매. 따라서, 세포에서는, Ub 의존적인 단백질 단백질 상호 작용의 수천이 있습니다, 대다수는 크고 다양한 표면을 통해 약한 상호 작용을 허용하는 낮은 친화성 그러나 높은 특이성을 가진 일반적인 표면을 인식합니다.

Ernst et al.은 여전히 높은 선택성을 유지하면서 관심있는 단백질에 대한 결합 친화성을 향상시킬 수 있는지 확인하기 위해 Ub의 알려진 결합 영역으로 돌연변이를 도입^{했습니다5}. 알려진 Ub-protein 상호 작용을 중재하는 Ub 표면의 위치에서 돌연변이가 있는 100억 개 이상의 (7.5 x ¹⁰¹⁰) Ub 변이체(UbV)의 결합 라이브러리가 개발되었습니다. 이 라이브러리는 다양한 UbV에 융합된 M13 박테리오파지 pIII 코트 단백질을 표현하는 파지미드로 구성되었습니다. 따라서, 개별 UbV는 발현 시 코트 단백질을 통해 파지 표면에 표시될 수 있다. 선택 과정에서, 대상 단백질과 상당한 결합 상호 작용을 가진 UbV를 표시하는 파지는 파지 디스플레이의 후속 라운드에서 유지되고 풍부하게 되는 반면, 대상 단백질에 제대로 결합되지 않는 UbV를 표시하는 파지는 파지 풀에서 세척되고 제거됩니다. 유지된 파지 입자는 표시된 UbV에 해당하는 파지미드를 함유하고 있어 한 번 격리된 후 시퀀싱되고 더 많은 특징을 가할 수 있습니다.

이 단백질 엔지니어링 전략을 사용하여, UbV 억제제는 인간 deubiquitinases5 및 바이러스 성 proteases6를 위해 개발되었습니다. 중요한 것은, 우리는 E2 결합 사이트를 납치하고 HECT 도메인7에 Ub 결합 외사이트를 차지하는 UbV를 활성화하여 인간 HECT 가족 E3 리그효소에 대한 억제 UbV를 생성^했습니다7. 또한 E2 결합 부위를 대상으로 단황 링 패밀리 E3s를 억제하고 UbV 이압을 유도하여 동종 형 링 E3s8을 활성화할 수 있습니다. 다중 서브유닛 링 E3의 경우, UbV는 링 하위 유닛(예: APC/C 복합체⁹)을 타겟팅하거나 복잡한 형성(예: SCF E3s10)을 방해하여 억제를 달성할 수 있다. UbV는 UB-proteasome 시스템(UPS)에서 단백질-단백질 상호 작용을 체계적으로 심문하여 UPS 효소의 생화학 적 메커니즘을 더 잘 해독하고 치료 개입을 위한 기능적 부위를 식별하고 검증할 수 있도록 활용할 수 있습니다.

다음 프로토콜은 이전에 생성된 파지를 사용하여 관심 있는 단백질을 타겟팅하는 방법과 연속적인 파지 디스플레이를 통해 대상 단백질과 상호 작용하는 UbV 바인더를 풍부하게 하는 방법을 설명합니다.