다기능 시스템을 사용하여 인간 암 및 정상 세포에 있는 예 관련 단백질의 모든 광학 Mechanobiology 심문
Summary
이 논문은 자동 다중 채널 이미징 및 메카노생물학적 분석을 가능하게 하는 통합다기능 및 사용자 프로그래밍 가능한 시스템을 활용하여 예관련 단백질(YAP)의 메카노 민감도를 해명하는 방법에 대한 상세한 단계별 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
라이브 셀의 장기적인 다기능 이미징 및 분석은 다양한 하드웨어 및 소프트웨어 플랫폼의 능률적이고 기능적인 조정이 필요합니다. 그러나, 다른 제조 업체에 의해 생산 된 다양한 장비의 수동 제어는 노동 집약적이고 시간이 많이 소요, 잠재적으로 획득 된 데이터의 정확성, 재현성 및 품질을 감소. 따라서 자동, 다기능 및 장기 이미지 수집을 가능하게 하고 대부분의 형광 현미경 플랫폼과 호환되는 올인원 및 사용자 프로그래밍 가능한 시스템은 과학 계에 도움이 될 수 있습니다. 이 백서는 (1) 자동 다중 채널 이미징 수집을 가능하게 하는 “자동 다기능 통합 프로그램(AMFIP)”이라는 홈 빌트 소프트웨어 프로그램, (2) 양적 이미징 분석 및 셀 트랙션 계산 패키지 제품군으로 구성된 새로운 통합 소프트웨어 시스템을 활용하는 완전한 운영 프로토콜을 소개합니다.
이러한 통합 시스템은 CRISPR/Cas9-엔지니어링 인간 정상 세포(B2B) 및 폐암 세포(PC9)에서 세포 확산 및 견인을 포함한 메카노 에민감한 예관련 단백질(YAP)과 세포 역학의 공간-측두형 분포 사이의 이전에 알려지지 않은 관계를 드러내기 위해 적용된다. 다중 채널 제어 및 판독의 이 시스템의 기능을 활용, 결과 보여줍니다: (1) B2B 정상 세포와 PC9 암 세포는 세포 확산 및 이동 과정 동안 YAP 발현, 견인 및 세포 역학 사이의 뚜렷한 관계를 보여줍니다; 및 (2) PC9 암세포는 기판에 눈에 띄는 페리 핵력을 적용한다. 요약하자면, 이 백서는 자동 다기능 이미징 및 분석을 가능하게 하는 통합된 사용자 프로그래밍 시스템을 활용하는 방법에 대한 상세한 단계별 프로토콜을 제시하여 YAP 메카노 민감도를 해명합니다. 이 공구는 세포 생리학 및 병리학의 맥락에서 다각적인 신호 역학의 상세한 탐구를 위한 가능성을 엽니다.
Introduction
이 방법의 전반적인 목표는 살아있는 세포의 모든 광학 다기능 화상 진찰 및 분석을 가능하게 하는 것입니다. 다기능 광전자 장치의 자동 조정을 가능하게 하는 올인원 이미징 프로그램은 노동 집약적이고 오류가 발생하기 쉬운 수동 작업을 줄이고 연구원이 장기 라이브 셀 이미징1,2,3,4를 수행하는 데 필수적입니다. 그러나, 생물 의학 연구 커뮤니티에 있는 대부분의 기존 공공 프로그램은 제한된 광전자 장치에만 적용하거나 다른 장비의 조정을 위한 추가 하드웨어를 요구합니다5,6,7,8,9. 최근에는 멀티 채널 및 시간 경과 이미징을 가능하게 하는 “자동 다기능 통합 프로그램(AMFIP)”이라는 제목의 오픈 소스 및 소프트웨어 기반 프로그램이 개발되었습니다. μManager11,12의 Java 언어와 애플리케이션 프로그래밍 인터페이스(API)를 기반으로 AMFIP는 사용자 지정 Java 스크립트를 실행하여 Nikon의 전자 하드웨어 및 소프트웨어 플랫폼의 소프트웨어 기반 통신을 수행하는 데 플러그인으로 개발되었습니다. AMFIP의 설립은 세포 행동의 프로그래밍 가능하고 다기능 적인 심문에 대한 가능성을 엽니 다. 이 백서에서 통합 된 실험 및 계산 시스템은 AMFIP와 디지털 이미징 분석 및 세포 견인력 현미경 을 결합합니다. 이 시스템은 CRISPR/Cas9가 설계한 인간 정상 B2B(도 1) 및 폐암 PC9(도 2) 세포주에서 뚜렷한 YAP 메카노생물학의 용해성을 가능하게 한다. 이 시스템은 과학 계에 모든 이미징 시스템과 호환되지 않을 수 있는 추가 제어 장치를 구매해야 하는 요구를 피하는 포괄적인 솔루션을 제공합니다.
이 논문에 제시된 프로토콜은 (1) AMFIP를 적용하여 mNEonGreen2 태그가 지정된 YAP를 표현하는 CRISPR/Cas9 엔지니어링 셀주 모두에 대한 자동 장기 이미징을 수행하는 방법을 소개합니다. (2) 피지 이미지J, MATLAB 및 Origin을 결합하여 형광 강도(그림 3 및 도 4), 세포 변위 필드(도 1C 및 도 2C), 셀룰러 견인력 필드(도 1D 및 도 2D)를 기반으로 YAP 핵/세포질(N/C) 비율의 정량적 분석을 위해 ). 결과는 (1) 생리적으로 관련된 기계적 강성을 갖는 기판에 퍼지는 세포의 첫 10 시간 동안 제안13,14,15,16,17,18, 단일 B2B 세포의 YAP N /C 비율은 단일 PC9 세포의 것과 비교하여 더 눈에 띄는 시간 의존적 변화와 변동을 보여줍니다 (그림 5 및 도 6 그림 6 ); (2) PC9 암세포는 페리 핵 영역에서 눈에 띄는 견인력을 생성한다(그림 7). 이 프로토콜에 기술된 통합된 체계 및 방법론은 세포와 광유전학 분자의 특정 모형을 초월합니다. 연구원은 그들의 특정 살아있는 세포 심문 실험을 커스터마이징하기 위하여 프로토콜을 적용하고 세포 생리학 및 병리학의 맥락에서 다각적인 신호 역학을 해명할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이미징 프로세스(Step 6.3)는 형광 이미지가 유효한 정량화 결과를 산출하기에 충분한 품질인지 확인하는 데 매우 중요합니다. 형광 단백질 또는 구슬의 z 스택 이미지는 샘플이 스위퍼하는 모든 Z 위치에 대한 초점 이미지를 포함할 만큼 충분히 큰 z-range가 있어야 합니다. 또 다른 중요한 단계는 세포를 용해 한 후 형광 구슬의 참조 이미지를 수집하는 것입니다 (단계 6.5). 참조 이미지는 6.3 단계에서 동일한 위치에서 촬영해야 하기 때문에 페트리 접시, 환경 챔버 및 현미경 사이에 상대적 변위가 유도되어서는 안됩니다. 용해 단계를 수행하는 조사관은 페트리 접시의 뚜껑을 제거하고 적용 된 기계적 교란이 환경 챔버에서 접시의 위치를 변경할 만큼 충분히 크지 않도록주의해야합니다.
실험 중에 발생할 수 있는 몇 가지 오류를 해결하기 위해 솔루션이 아래에 제공됩니다. 6.4 단계에서 Enter 를 클릭한 후 매크로가 활성화되지 않으면 화면의 왼쪽 하단 영역이 요소가 아닌 창에 의해 점유되기 때문일 수 있습니다. 이러한 경우 요소에서 매크로를 활성화할 수 있도록 창의 왼쪽 아래쪽 영역을 지워야 합니다. 또 다른 일반적인 오류는 밝은 필드 이미지가 검은색으로 표시된다는 것입니다. 이 문제는 형광및 밝은 필드 이미지의 수집 사이의 시간 간격이 부족하여 발생합니다. 형광 화상 진찰 시간 계산에 있는 약간 지연은 시간이 지남에 따라 축적하고 상당한 지연을 일으키는 원인이 되고 밝은 필드 화상 진찰을 방해할 수 있습니다. 한 가지 해결책은 연속 모션의 시작 사이의 시간 간격보다 적게 (동일하지 않음)하는 모든 위치의 하나의 이미징 주기의 지속 시간을 조정하는 것입니다. 이 작업은 시간 계산을 새로 고치고 각 이미징 주기의 시작 부분에서 누적 오류를 제거합니다.
이 모든 광학 심문 기술은 (1) 니콘을 포함하되 이에 국한되지 않는 광범위한 하드웨어/소프트웨어를 지원하며, (2) 젤라틴, PEG, Matrigel 및 콜라겐 I 젤을 포함한 다양한 유형의 검증된 하이드로겔 시스템, (3) 연구원의 다양한 요구에 따라 프로그래밍 가능한 사용자 정의를 지원합니다. 그러나, 상용 현미경으로부터 하부 수준의 제어 기능을 사용할 수 없는 경우 AMFIP를 사용하는 기능의 사용자 지정이 어려워집니다. 이 기술의 또 다른 제한은 XY 및 초점(Z) 평면 모두에서 샘플의 공간 드리프트입니다. 이러한 제한은 이미지의 후처리 중에 극복할 수 있지만, 샘플의 실시간 드리프트를 보정하기 위해 자동 초점 기능을 개선하는 것이 필수적입니다. 이러한 개선은 이미징 프로세스의 처리량을 증가시키고 실험 중 드리프트로 인한 잠재적 인 오류를 줄일 수 있습니다.
YAP와 같은 메카노트랜스듀서는 유망한 암 치료의 개발을 위한 새로운 치료 목표역할을 할 수 있습니다25,26,27. 신흥 데이터는 YAP가 암세포의 증식 그리고 침략을 승진시키는 것을 건의합니다. 역학 유도된 YAP 전좌는 세포질에서 핵으로의 YAP 전좌를 활성화하여 세포 이동, 증식, 침략 및 세포멸과 관련된 유전자의 전사를 활성화하여 비정상적인 세포 거동을 유도28,29,30,31로 이어집니다. 이 작품은 2개의 전형적인 인간 적인 폐암 및 일반적인 세포주에서 YAP N/C 비율 및 세포 역학의 잠재적인 상관관계를 탐구하는 것을 목표로 했습니다. 10h 세포 확산 기간 동안, PC9 세포는 핵 및 세포질에서 유사한 YAP 농도를 나타내게 한다(도 3D 및 도 5A). B2B 세포는 세포질(도 3C 및 도 5A)보다 핵에서 더 높은 YAP 농도를 나타내고 있다. 초기 퍼지는 단계에서 찾아낸 이 관계는 정상과 암세포 사이 핵에 있는 YAP 사격을 비교하는 간행된 사실 인정의 대다수와 다릅니다. 비록 반드시 초기 확산 단계에서, 대부분의 출판 된 사실 인정은 YAP정상 세포의 핵에서 보다는 암세포의 핵에 더 집중되어 있다는 것을 보여줍니다27,28. 유방암에 대한 단 하나의 연구는 예외를보고32 YAP가 폐암 PC9 세포에서 만든 우리의 현재 관찰에 동의 세포질에 더 집중되어 있음을 보여줍니다. 저자의 지식의 최고에, 이 작품은 인간 폐암 세포주에서 더 낮은 YAP N/C 비율을 보여주는 첫번째입니다. 저자는 PC9 세포에서 안정적인 YAP N/C 비율에 대한 이유가 초기 확산 단계에서 PC9 세포에서 세포/핵 확산 영역 및 견인의 낮은 변이 때문일 수 있다고 가설. PC9 및 B2B 세포에서 낮은 YAP N/C 비율의 기초 분자 메커니즘의 해부는 진행 중이다.
확산의 처음 10h 동안, 이들 두 세포주들은 YAP N/C 비율, 세포 견인력 및 퍼짐 영역(도 5)과 뚜렷한 관계를 보여준다. B2B 세포의 경우, 더 높은 YAP N/C 비율은 다른 정상 세포의 보고된 데이터와 일치하는 더 높은 세포 및 핵 확산 영역(도 6A,B)과 상관관계가 있다33. 흥미롭게도, 이 관계의 발달 추세는 일반적으로 기록된 모든 B2B 세포에서 발견되더라도, 이 관계의 2개의 다른 도 (높고 낮은) 찾아낸다. 동시에 퍼지고 이동하는 B2B 세포는 더 높은 YAP N/C 비율 (2.05 ± 0.32)을 가진 더 낮은 견인및 더 높은 세포 및 핵 퍼짐 영역을 보여줍니다. 동일한 위치에 퍼지고 남아있는 B2B 세포의 경우, 더 낮은 YAP N/C 비율(1.74 ± 0.21)을 가진 더 높은 견인력과 낮은 세포 및 핵 확산 영역을 보여줍니다. 이러한 두 가지 관계는 분산된 분산 된 데이터 그룹(그림 6C,D)에서 보여 지립니다. 문헌에 보고된 바와 같이, 배아 섬유아세포 NIH 3T3 세포와 같은 고정된 정상 세포는 철새 세포34보다 더 높은 견인력을 갖는다. 이 논문에 보고된 데이터는 확산 및 비 마이그레이션 B2B 세포가 B2B 세포를 퍼지고 마이그레이션하는 것보다 더 높은 견인력을 적용했다는 것을 건의하며, 이는 기판에서 안정화하기 위해 비마이그레이션 셀에 높은 견인력이 필요하다는 것을 시사합니다.
또한, 이러한 데이터는 고정된 정상 B2B 세포가 더 높은 페리 핵력을 생성한다는 것을 보여주고, 다른 연구원에 의해 수행된 이전 연구는 고정 된 세포의 주변에서 생성 된 단지 더 높은 세포 견인을보고하는 반면34,35,36,37. 저자는 실험에서 마이그레이션의 본질적인 경향의 차이가 이러한 모순된 결과를 일으킬 수 있다고 생각합니다. 발표된 실험에서, 사각형 모양의 마이크로패터닝은 단일 세포가 확산되는 것을 제한하고 이동을 억제하는 데 사용되었습니다. 세포가 이동하는 경향이 있었는지 여부는 알 수 없습니다. 철새 세포는 종종 셀38의 주변에서 높은 견인력을 나타내기 때문에 마이그레이션하는 경향이있는 세포는 마이그레이션이 제한되어 있어도 여전히 높은 주변 견인력을 유지할 가능성이 높습니다. 이 본 연구에서, 고정 된 세포는 어떤 micropattern에 의해 제한 되지 않습니다 하지만 마이그레이션 하지 않습니다., 세포 그들의 비 마이그레이션 상태를 유지 하는 경향이 나타내는. 또 다른 가능성은 마이크로패턴에 의해 정의된 세포 형상이 초점 접착력 및 견인력39의 분포에 영향을 줄 수 있다는 것입니다. 이 연구의 결과는 어떤 고정 마이크로 패턴없이 생성되고 원래 모양의 고정 된 세포의 힘 분포를 나타냅니다.
저자의 지식의 최고에, 현재까지 단 하나의 간행물은 특히 정상 세포에서 peri-nuclear 힘의 발견을 보고 (마우스 배아 섬유 아 세포), 잠재적으로 핵을 가로 질러 액틴 캡에 의해 발생 40. YAP 세포질-핵 전좌는 페리 핵무력40의 증가와 상관관계가 있다. 관련 문헌에 대한 철저한 수색은 암세포에서 페리 핵력 또는 액틴 캡을 보고하는 출판물을 산출하지 못했습니다. 흑색종 암세포에 대한 간접적인 연구는 액틴 림(핵을 덮지 않고 주변에 위치하지만 핵을 커버하지 않는 또 다른 페리 핵 액틴 조직)이 세포 이동률41을 감소시키고, 간접적으로 페리 핵력의 존재를 시사한다는 것을 입증하였다. 그러나 직접 실험 데이터는 보고되지 않습니다. 이 연구에서, 저자는 PC9와 B2B 세포 모두 peri-nuclear 변위와 견인을 보여줍니다 발견. 페리 핵군 세대의 메커니즘과 그 효과는 여전히 논란의 여지가 있다. 정상 세포에서, 액틴 캡은 핵 형태와 크로마틴 조직(42)을 조절하고, 뉴클레오골격 및 세포골격(LINC) 복합체(LINC)의 링커를 통해 초점 접착으로부터 핵으로 기계적 신호를 전송하고, 세포 마이그레이션444를 조절하는 역할을 하는 것으로 보고되었다. 라빈 A/C는 액틴 캡40,41,42,43,44의 형성과 중단과 관련이 있다. 그러나 액틴 캡이 페리 핵력을 생성한다고 주장한 보고서는 액틴 림40의 잠재적 역할을 고려하지 않았다. 암세포에서 Lamin A의 과발현은 액틴 림의 형성을 용이하게 하고 암세포 이동을 제한합니다. Lamin B의 과발현은 액틴 림 형성을 줄이고 마이그레이션을 촉진합니다. 페리 핵 행위의 존재와 라빈 A의 효과로 인해 이 과정에 페리 핵무력이 관여할 수 있다. 그러나, 이 연구 결과는 측정된 페리 핵군의 증거 또는 액틴 캡의 행동을 보여주지 않았다. 따라서, 본 연구에서 PC9 세포에서 페리 핵군의 발견은 폐암 세포에 있는 peri-nuclear 힘 및 변위를 보여주는 첫번째 보고입니다. 저자는 현재 CRISPR/Cas9 엔지니어링 PC9 및 B2B 세포에 있는 peri-nuclear 힘의 분자 기계장치 그리고 기능을 조사하고 있습니다.
이 논문에서 입증되는 모든 광학 메카노생물학 심문을 넘어, 통합다기능 시스템은 생체 시스템의 다른 필수 생리및 병리학 적 신호를 광학적으로 탐사하기 위해 적용 될 수 있습니다. 예를 들어, 저자의 실험실은 최근 3개의 빛 반응형 멤브레인 단백질을 공동 발현하는 여러 개의 안정적으로 트랜스포송된 인간 암 세포주를 설치했습니다: 멤브레인 전압 표시기 QuasAr2 (흥분: 640 nm; 방출: 660 nm-740 nm), 멤브레인 전압 탈극기 CheRiff (여기: 488 nm), 및 멤브레인 전압 과극제 (nNP3). 이 세 가지 기능성 단백질은 교차토크가 없는 방식으로 스펙트럼 직교 레이저 라인에 의해 활성화될 수 있으며, 멤브레인 전기 생리학의 모든 광학 양방향 신호 통신(readout 및 제어)을 가능하게 합니다. 통합 된 광전자 시스템과 수동 패치 클램프를 사용하여 저자는 단일 인간 암 세포 및 다세포 종양 스페로이드에서 멤브레인 전압 (Vm)의 모든 광학 제어 및 판독을 검증했습니다. 모든 광학 전기 생리학 심문은 암세포에서 이전에 접근할 수 없었던 바이오 전기의 상세한 탐사 가능성을 열어주며, 이는 새로운 축에서 종양 생물학을 발전시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 UF 건강 암 센터 (X. T. 및 D.S.)와 게토레이 상 스타트업 패키지 (X. T.)의 암 파일럿 어워드에 의해 재정적으로 지원됩니다. 저자는 진심으로 박사와의 지적 토론과 기술 적 지원을 주셔서 감사합니다. 조나단 리히트 (UFHCC), 롤프 렌 박사 (UFHCC), 박사. 이지현 (생물 통계, UF), 박사 휴 팬 (MAE, UF), 박사 워렌 딕슨 (MAE, UF), 박사 가투 수바시 (MAE, UF), 박사 마크 셰락 (MAE & ECE, UF), 박사 Malisa 사렌토란 (매, ECE, UF), 박사 말리사 사렌토란트 (매, 박사. UF), 매튜 트라움 박사(MAE, UF), 데이비드 한 박사(애리조나 대학교), 웨이홍 왕 박사(오라클 코퍼레이션), 유화탄 박사(홍콩 폴리테크닉 대학), 니콘 지원팀(호세 세라노-벨레즈, 래리 코돈, 존 에크만). 저자는 탕의 모든 구성원에서 관대 하고 효과적인 지원에 깊이 감사, Siemann’s, 관의 연구 실험실 및 MAE & ECE 및 물리학 및 방사선 종양학 부서의 모든 직원, UF.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-aldrich | 440140 | |
| 0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| 8 Benchtop Centrifuge | Thermo | 75007210 | |
| A1R confocal system | Nikon | HD25 | |
| Acetic acid | Sigma-aldrich | 695092 | glacial, ACS reagent, ≥99.7% |
| BEAS-2B (B2B) cells | Sigma-aldrich | 95102433 | human epithelial cells from lung tissue |
| Carboxylate-Modified Microspheres | Invitrogen | F8797 | |
| Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
| Desktop Computer | Dell | 2018 | with Windows 10 operating system |
| Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | 1.53k | |
| Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| HEPES buffered saline | Sigma-aldrich | 51558 | |
| Hydrazine hydrate solution | Sigma-aldrich | 53847 | |
| IntelliJ IDEA | JetBrains | 2020 | Java development platform |
| Java Development Kit | Oracle | 14.0 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 3066-05 | |
| MATLAB | MathWorks | 2020b | |
| Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-218 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide solution | Sigma-aldrich | M1533 | |
| NIS-Elements software platform | Nikon | 4.50 | software platform |
| Origin | OriginLab | OriginPro 2017 (Learning Edition) | data analysis and graphing software |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PC9 cells | Sigma-aldrich | 90071810 | human adenocarcinoma cells from lung tissue |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-553S | high-fidelity DNA polymerase |
| Scotch tape | Scotch | adhesive tape | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-aldrich | 05030 | |
| Super glue | Gorilla | cyanoacrylate glue | |
| Ti2-E inverted microscope | Nikon | MEA54000 | |
| TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder | Nikon | MEC56120 | |
| μManager | version 2.0 gamma | open source microscopy software (https://micro-manager.org/) |
References
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