Optogenetische faseovergang van TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven

Ribonucleoproteïne (RNP) korrels regelen een groot aantal cellulaire activiteiten in de kern en het cytoplasma door membraanloze partities te assembleren via vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS), een fenomeen waarbij een homogene vloeistof zich ontmengt in twee verschillende vloeibare ^fasen1,2. De ontregelde LLPS van RNA-bindende eiwitten die normaal functioneren als RNP-korrelcomponenten bevorderen abnormale faseovergang, wat leidt tot eiwitaggregatie. Dit proces is betrokken bij neurologische en neurodegeneratieve ^ziekten3,4,5. De precieze evaluatie van een oorzakelijk verband tussen afwijkende LLPS van RNA-bindende eiwitten en ziektepathogenese is cruciaal om te bepalen of en hoe LLPS kan worden benut als een effectief therapeutisch doelwit. LLPS van RNA-bindende eiwitten is relatief eenvoudig te bestuderen in vitro en in eencellige modellen, maar is moeilijk in meercellige organismen, vooral bij gewervelde dieren. Een kritieke vereiste voor het analyseren van dergelijke LLPS in individuele cellen in een weefselomgeving is om stabiel een sonde uit te drukken voor de beeldvorming en manipulatie van LLPS in een ziektegevoelig celtype van belang.

Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is een uiteindelijk fatale neurologische aandoening waarbij motorneuronen van de hersenen en het ruggenmerg selectief en progressief verloren gaan als gevolg van degeneratie. Tot op heden zijn mutaties in meer dan 25 genen geassocieerd met de erfelijke (of familiale) vorm van ALS, die goed is voor 5%-10% van de totale ALS-gevallen, en sommige van deze ALS-veroorzakende genen coderen voor RNA-bindende eiwitten bestaande uit RRP’s, zoals hnRNPA1, TDP-43 en ^FUS6,7. Bovendien wordt de sporadische vorm van ALS, die goed is voor 90%-95% van de totale ALS-gevallen, gekenmerkt door de cytoplasmatische aggregatie van TDP-43 afgezet in degenererende motorneuronen. Een belangrijk kenmerk van deze ALS-geassocieerde RNA-bindende eiwitten zijn hun intrinsiek ongeordende regio’s (IDR’s) of laagcomplexe domeinen die geordende driedimensionale structuren missen en zwakke eiwit-eiwitinteracties bemiddelen met veel verschillende eiwitten die ^LLPS7,8 aandrijven. Het feit dat ALS-veroorzakende mutaties vaak voorkomen in de IDR’s heeft geleid tot het idee dat afwijkende LLPS en faseovergang van deze ALS-gerelateerde eiwitten ten grondslag kunnen liggen aan als ^{pathogenese9,10}.

Onlangs werd de optoDroplet-methode ontwikkeld, een op Cryptochrome 2 gebaseerde optogenetische techniek die de modulatie van eiwit-eiwitinteracties door licht mogelijk maakt, om faseovergang van eiwitten met IDR’s ^{te induceren11}. Aangezien deze techniek met succes is uitgebreid tot TDP-43, is het begonnen met het blootleggen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologische faseovergang van TDP-43 en de bijbehorende cytotoxiciteit12,13,14,15. In dit protocol schetsen we een genetische methode om een optogenetische TDP-43 af te leveren aan ALS-kwetsbare celtypen, namelijk spinale motorneuronen in zebravissen met behulp van de BAC voor het mnr2b/mnx2b-gen dat codeert voor een homeodomain-eiwit voor motorneuronspecificatie16,17. De hoge doorschijnendheid van zebravislarven zorgt voor eenvoudige, niet-invasieve lichtstimulatie van de optogenetische TDP-43 die de faseovergang in de spinale motorneuronen veroorzaakt. We presenteren ook een basisworkflow voor de live beeldvorming van de spinale motorneuronen van de zebravis en beeldanalyse met behulp van de vrij beschikbare Fiji / ImageJ-software om de reacties van de optogenetische TDP-43 op de lichtstimulatie te karakteriseren. Deze methoden maken een onderzoek mogelijk naar de TDP-43-faseovergang in een ALS-kwetsbare cellulaire omgeving en moeten helpen om de pathologische gevolgen ervan op cellulair en gedragsmatig niveau te onderzoeken.