JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物工程

In Vitro Mikro Organik Yük modüle Edilmiş Alan Etkili Transistör Dizileri ile ÇokParametrik Hücresel Analiz

Published: September 20, 2021
doi:
10.3791/62907
,
1Department of Electrical and Electronic Engineering,University of Cagliari

Summary

Burada, in vitro hücresel interfacing için organik yük modülasyonlu alan etkili transistör (OCMFET) tabanlı bir cihazın imalat protokolünü sunuyoruz. Mikro OCMFET dizisi olarak adlandırılan cihaz, elektroaktif hücre kültürlerinin elektriksel ve metabolik faaliyetlerinin izlenmesini sağlayacak esnek, düşük maliyetli ve referanssız bir cihazdır.

Abstract

Modern elektrofizyoloji, giderek daha karmaşık hale gelen araç ve gereçlerin paralel gelişimi ile sürekli olarak beslenmiştir. Buna karşılık, bu alandaki keşifler, son 50 yılın etkileyici başarılarını belirleyen ileri geri bir süreçte teknolojik ilerlemeyi yönlendirdi. Bununla birlikte, hücresel etkileşim için kullanılan en çok kullanılan cihazlar (yani, transistörlere dayanan mikroelektrod dizileri ve mikroelektronik cihazlar) hala yüksek maliyet, malzemelerin sertliği ve harici bir referans elektrodun varlığı gibi çeşitli sınırlamalar sürmektedir. Bu sorunların kısmen üstesinden gelmek için, organik biyoelektronik adı verilen yeni bir bilimsel alanda gelişmeler oldu ve bu da daha düşük maliyet, daha uygun malzemeler ve yenilikçi imalat teknikleri gibi avantajlarla sonuçlandı.

Son on yıl içinde hücre kültürleriyle rahat bir şekilde arayüz yapmak için birkaç ilginç yeni organik cihaz önerildi. Bu makalede, organik yük modüle edilmiş alan etkili transistöre (OCMFET) dayalı hücresel interfacing için cihazların imalatı için protokol sunulmaktadır. Mikro OCMFET dizileri (MOAs) olarak adlandırılan bu cihazlar, organik elektroniklerin avantajlarını ve OCMFET’in kendine özgü özelliklerini birleştirerek kardiyomiyositlerin ve nöronların hem elektriksel hem de metabolik aktivitelerini izlemenin mümkün olduğu şeffaf, esnek ve referanssız araçlar hazırlar ve böylece elektrojenik hücre modellerinin çok boyutlu bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Introduction

Nöronlar ve kardiyomiyositler gibi elektroaktif hücrelerin in vivo izlenmesi, insan beyni için temel araştırma uygulamalarında, fonksiyonel bağlantı çalışmalarında, farmakolojide ve toksikolojide geçerli ve güçlü bir yaklaşımı temsil eder. Bu tür çalışmalar için genellikle kullanılan araçlar esas olarak mikroelektod dizilerine (MEAs)1,2,3,4,5 ve giderek daha verimli ve güçlü alan etkili cihazlara (FED’ler)6,7,8,9,10,11,12 dayanır. . Bu iki cihaz ailesi, nöronların ve kardiyomiyositlerin elektriksel aktivitesinin gerçek zamanlı izlenmesine ve uyarılmasına izin verir ve genellikle sağlamlık, kullanım kolaylığı ve güvenilirlik ile karakterize edilir. Bu özellikler, MEA’ları ve FED’leri elektrofizyolojik uygulamalar için altın standart haline getirir ve şu anda standart hücresel kültürler, organotipik beyin dilimleri ve üç boyutlu organoidlerle arayüz sağlamak için 13,14,15,16. Yaygın kullanımlarına ve etkileyici özelliklerine rağmen, MEA’lar ve FED’ler yüksek maliyet, malzemelerin sertliği ve ölçüm sıvısı ortamına yerleştirilmesi gereken ve cihazların düzgün çalışması için gerekli olan genellikle hacimli bir referans elektrodun varlığı gibi bazı sınırlamalar sunar.

Hücresel etkileşim için alternatif çözümleri araştırmak için, son on yılda organik malzemelere ve yenilikçi imalat tekniklerine dayalı elektronik cihazların incelenmesi için çok çaba sarf edildi17. Yukarıda belirtilen sınırlamaları ele almak için çalışılan birkaç organik cihaz arasında, OCMFET adlı tuhaf bir organik transistör son zamanlarda MEA’lara ve FED’lere geçerli bir alternatif olarak önerilmiştir18. Organik elektronik teknolojisinin sunduğu düşük maliyetli malzemeler ve imalat teknikleri, optimum mekanik ve kimyasal özellikler, optik şeffaflık ve biyouyumluluk gibi standart özelliklere ek olarak, OCMFET ayrıca harici bir referans elektrota ihtiyaç duymadan ultra yüksek şarj hassasiyeti (çift kapılı yapısı nedeniyle) sunar. Ayrıca, bu organik sensör, transistör alanından ayrılan algılama alanının spesifik işlevselleşmesine bağlı olarak farklı analiz / fiziksel parametreleri algılama yeteneğine sahiptir19,20. Tüm bu özellikler, hücresel bir kültür içinde farklı parametrelerin edinilmesi için rahatça kullanılabilir. Özellikle, nöronal / kardiyak elektriksel aktiviteyi tespit edebilmenin yanı sıra, hücresel metabolik aktivitenin neden olduğu hafif lokal pH varyasyonlarını güvenilir bir şekilde izlemek için basit bir fiziksel işlevselleştirme21 kullanarak OCMFET’in kendine özgü çift kapılı yapısının sunduğu ultra yüksek pH duyarlılığından yararlanmak da mümkündür.

İn vitro hücre biyosensörasyonunda, hücresel metabolik aktivitenin izlenmesi kültürün durumunun güçlü bir göstergesidir ve ilaç kullanımı ve elektriksel stimülasyon22,23 gibi çeşitli uyaranlara hücresel yanıtı değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, özel sinir uygulamaları durumunda, hem elektriksel hem de metabolik aktivitelerin izlenmesi, özellikle farmakoloji ve toksikolojide büyük ilgi çekicidir24. Modern in vitro elektrofizyolojinin gereksinimlerini kolayca ele almak ve aynı zamanda OCMFET’in tüm avantajlarını sunmak amacıyla, micro OCMFET Array (MOA) adlı bir cihaz yakın zamanda tanıtıldı. MOA, elektrojenik hücre kültürlerinin multiparametrik analizini sağlayan, özellikle in vitro hücresel etkileşim için tasarlanmış özel algılama alanlarına sahip OCMFET tabanlı bir dizidir. Özellikle, iki MOA kanalı hassasiyetlerini en üst düzeye çıkarmak için daha büyük algılama alanlarına sahiptir ve kültür ortamının pH varyasyonları gibi belirli ilgi parametrelerini izlemek için seçici olarak işlevsel hale getirilebilir. Yapıdaki diğer OCMFET’ler hücre dışı elektriksel aktivite sensörleri görevi görür. Şekil 1, 16 kanallı bir MOA’nın yapısını göstermektedir. Bu yetenek, harici bir referans elektrodun yokluğu ile birlikte, MOA’yı in vitro uygulamalar için çok ilginç bir araç haline getirir. Bu çalışma, nöronların ve kardiyomiyositlerin elektriksel ve metabolik faaliyetlerinin in vitro tespiti için çok duyarlı bir MOA’nın adım adım fabrikasyon protokolünü sunun. Şekil 2 ana imalat adımlarını, kullanılan malzemeleri ve cihaz yapısını göstermektedir.

Protocol

Hayvanların bakımı ve kullanımı için geçerli tüm uluslararası, ulusal ve/veya kurumsal yönergelere uyuldu. Proje için hayvan sayısını azaltmak ve acılarını en aza indirmek için tüm çabalar sarf edildi. 1. Gelişen çözeltinin hazırlanması, gravür çözeltileri, organik yarı iletken çözelti ve fotolitografik maskeler NaOH peletlerini 175 mM konsantrasyonda deiyonize suda seyrelterek gelişen çözeltiyi hazırlayın.NOT: Bu eksotermik bir reaksiyondur. Plastik bir kap kullanılırsa, tüm peletler tamamen çözünene kadar kabı ajite etmeye devam edin. Hidroflorik asidi (HF) deiyonize suda seyrelterek titanyum gravür çözeltisini hazırlayın (konsantre% 48 HF’nin 1 kısmı, 49 parça deiyonize su).DİkKAT: Hidroflorik asit cilde kolayca nüfuz ederek derin doku katmanlarına ciddi zararlar verebilir. HF’nin hızlı nötralizasyon, günlerce devam edebilecek ve ciddi yaralanmaya ve hatta ölüme neden olabilecek doku yıkımını önlemek için gereklidir. HF ile ilişkili riskler, asitle temasın konsantrasyonuna ve süresine bağlıdır. Yüz kalkanı kullanarak sadece duman kaputunun altında kullanın. Çift gloving de şiddetle tavsiye edilir. İyot, potasyum iyodür ve deiyonize suyu karıştırarak altın aşındırma çözeltisini hazırlayın (250 g çözelti için 200 mL deiyonize su, 20 g KI, 5 g I2 kullanın). Çözeltiyi oda sıcaklığında 1 saat karıştırın ve kullanmadan önce gece boyunca dinlendirin. 6,13-bis (triisopropylsilylethynyl) pentaceni (TIPS Pentacene) anisole (ağırlık olarak% 1) çözünerek ve 80 ° C’de bir sıcak plaka üzerinde 2 saat boyunca hafifçe karıştırarak yarı iletken çözeltiyi hazırlayın.NOT: Bu çözümü karıştırmaya devam edin. Kehribar cam şişeleri kullanın ve/veya düşük ışık koşullarında saklayın. Vektörel grafik yazılımı ile istediğiniz fotolithografik maske setini hazırlayın. Tüm işlem için 5 maske hazırlayın: yüzen kapıların (FG’ler) deseni için maske; viaların açılması için maske ve elektrofizyolojik kayıtlar için algılama alanları; kendi kendine hizalama işlemi için maske; kaynağın deseni için maske, drenaj ve kontrol kapısı üst teması; ve pH kanallarının plazma aktivasyonu için maske.NOT: Gerekli çözünürlüğe ve spesifik fotolitografik kuruluma bağlı olarak farklı maske türleri kullanılabilir. Önerilen cihazlar (maksimum yanal çözünürlüğe sahip 40 μm) durumunda, basit plastik esnek maskeler yerel bir fotokopi dükkanından satın alınmıştır. 2. Substrat seçimi ve hazırlanması Bozulmamış bir PET tabakadan 250 μm polietilen tereftalattan (PET) 6 x 6 cm2 kare kesin.NOT: Standart laboratuvar cımbızlarıyla zarar vermeden manipülasyona izin vermek için yeterince geniş kenar boşluklarına sahip olmak için son cihazdan biraz daha büyük bir substratla başlayın. Derin olukların ve çiziklerin varlığını dışlamak için alt tabakayı optik mikroskopla inceleyin. Daha büyük kusurlar son cihazın arızalanmasına neden olabileceğinden, daha az çizilmiş alt tabakaları dikkatlice seçin. PET substratlarını aseton, izopropil alkol ve deiyonize su (bu sırayla) ile durulayın ve azot akışlarını kullanarak kurutun. Substratları temiz plastik Petri kaplarında / kaplarında saklayın. 3. FG: titanyum birikimi Substratları plazma oksijeni (100 W’ta 30 sn) ile önceden temizleyin ve termal evaporatörün vakum odasının içindeki substrat tutucuya yerleştirin. Potaya 60 mg titanyum yerleştirin, deklanşörü kapatın ve 10-6 Torr’dan daha düşük bir vakum seviyesine ulaşana kadar buharlaşma odasını pompalayın. Pota kırmızı parlayana kadar evaporatörun gücünü artırın ve 30 s bekleyin. Deklanşörü açın, gücü % 60’a çıkarın (veya pota parlak beyaz parlayana kadar) ve 60 s bekleyin. Deklanşörü kapatın ve gücü kısın. Alt tabakaları evaporatörden çıkarın; aseton, izopropil alkol ve deiyonize su kullanarak temizleyin; ve azot akışlarını kullanarak kurutun. Titanyum yüzeyi hafifçe oksitlemek için ikinci bir oksijen plazması tedavisi (200 W’ta 60 sn) gerçekleştirin. 4. FG desenleme Duman kaputunun içine yerleştirilmiş spin kaplayıcıya her seferinde bir substrat yerleştirin. Tek kullanımlık plastik pipet kullanarak alt tabakaya 4 mL fotoresist yatırın. 2 μm kalınlığında bir fotoresist tabaka elde etmek için aşağıdaki spin kaplama parametrelerini kullanın: dönüş hızı: 3000 rpm; dönüş süresi: 45 s; hızlanma süresi: 0,5 sn; delerasyon süresi: 0.5 sn. Fotoresisti, alt tabakayı sıcak bir tabağa (5 dakika için 70 °C) yerleştirerek yumuşak pişirin. Doğrudan ışığa maruz kalmamak için substratı alüminyum folyoya sarılı petri kabı/plastik bir kabın içinde saklayın.NOT: Substrat deformasyonunu önlemek için önerilen fırın sıcaklığından (50 s için 100 °C) kaçının. Bununla birlikte, daha uzun süre daha düşük bir sıcaklıkta pişirmek iyi sonuçlar sağlar. Cihazı bir bromografa yerleştirin ve istenen FG düzenine sahip plastik fotolithografik maskeyi alt tabakaya yerleştirin. 1 dakika boyunca üstten ultraviyole (UV) ışığa maruz durun ve maskeyi çizmemek için maskenin alt tabaka üzerindeki yanal hareketlerini en aza indirmeye dikkat ederek maskeyi dikkatlice çıkarın. Alt tabakayı 5 sn boyunca gelişmekte olan çözelti ile dolu bir cam kaba daldırın (adım 1.1). Deiyonize suda hızla durulayın ve azot altında kurulayın. Alt tabakada az gelişmiş/aşırı gelişmiş noktalar aramak için optik mikroskop kullanın. Az gelişme durumunda çözelti geliştirmede substratın daldırılmasını tekrarlayın. Maruz kalan titanyumu titanyum aşındırma çözeltisi (adım 1.2) içine 15 sn batırarak kazıyın, deiyonize suyla durulayın ve azot kullanarak kurutun. Alt tabakayı optik olarak inceleyin ve aseton kullanarak fotoresisti çıkarın. Substratı izopropil alkol ve deiyonize su ile durulayın ve azotla kurulayın. 5. Kapı dielektrik birikimi Bir laboratuvar mendili kullanarak biriktirme odası duvarlarında 2 mL yapışıklık promotörü (silane – 3-(trimethoxysilyl)propil methacrylate) dağıtarak Parylene kaplayıcının biriktirme odasını hazırlayın. Parylene kaplayıcının üzerine 300 mg Parylene C dimer (150 nm’lik son kalınlıklara karşılık gelen) yerleştirin. Düşük basınç değerini 7 mbar, yüksek basınç değerini ise 10 mbar olarak ayarlayın. Biriktirmeden sonra, substratları aseton, izopropil alkol ve deiyonize su ile temizleyin ve azotla kurulayın. 6. OCMFET’in algılama alanlarının elektriksel aktivite kaydı ve FG’lerin arkasına erişmek için viaların oluşumu için açılması Fotoresisti, 4.1 ve 4.2 adımlarının aynı parametrelerini kullanarak alt tabakalara yatırın. Cihazı bir bromografa yerleştirin ve plastik fotolitografik maskeyi vias için alt tabakaya yerleştirin (algılama alanları üzerinde 50 μm çapında dairesel açıklıklar ve 100 x 10 Hizalama hassasiyetini artırmak için stereoskopik bir mikroskop altında algılama alanlarından uzakta (Şekil 1 ve Şekil 2’deki FG’lerin sırt teması olarak adlandırılır) FG’ler üzerinde 0 μm2 açıklıklar. UV ışığına 1 dakika boyunca üstten maruz durun ve maskeyi çizmemek için alt tabaka üzerindeki yanal hareketlerini en aza indirmeye dikkat ederek maskeyi dikkatlice çıkarın.NOT: FG’lerin algılama alanından uzakta yan tarafındaki vialar ( Şekil 1 ve Şekil 2’de FG’lerin sırt teması olarak gösterilir) transistörün karakterizasyonu sırasında temas için gereklidir. Ayrıca, FG’lere elektrik erişimine sahip olmak, farklı işlevselleştirme türleri (örneğin, elektrodepozisyon) için çok yararlı olabilir. Fotoresisti daha önce 4.4 adımında açıklandığı gibi geliştirin. Parylene C’yi algılama alanlarından çıkarmak için alt tabakayı desenli fotoresist (burada maske görevi görür) oksijen plazmasına (200 W’ta 180 sn) maruz bırakın.NOT: Parylene C’nin 200 W’da izotropik plazma temizleyicide gravür oranı yaklaşık 90 nm/dk’dır. Algılama alanlarını daha fazla temizlemek için hafif bir fazla kazık gerçekleştirilir. Fotoresist de işlem sırasında kazınmıştır. Bununla birlikte, kalınlığı (2 μm) Parylene C’den çok daha yüksektir. Fotoresisti tamamen çıkarmak için 10 s boyunca ultrasonik banyonun içinde asetonla dolu bir cam kaba substratları yerleştirin. Substratları aseton, izopropil alkol ve su ile durulayın ve azotla kurulayın.NOT: Alt tabakaları asetonla durulamak yerine sonikasyon kullanmak, Parylene C parçalarının algılama alanlarının yüzeyine istenmeyen katlanmasını ve yeniden birikmesini önlemek için çok önemlidir. 7. Kaynağın kendiliğinden hizalanması ve FG ile boşaltılması Fotoresisti, 4.1 ve 4.2 adımlarının aynı parametrelerini kullanarak alt tabakalara yatırın. Cihazı bir bromografa yerleştirin ve transistörün alanlarını tamamen kaplayan basit siyah dikdörtgenlere sahip plastik bir fotolithografik maskeyi substratın üzerine yerleştirin. Hem üstten hem de alttan 1 dakika boyunca UV ışığına maruz durun ve maskeyi çizmemek için alt tabaka üzerindeki yanal hareketlerini en aza indirmeye dikkat ederek maskeyi dikkatlice çıkarın.NOT: Çift taraflı pozlama ile FG’ler alt maruziyete göre fotolithografik maske görevi görürken, üst maskenin varlığı transistörlerin kanalında bulunan fotoresistin pozlanmamış kalmasını sağlar. Fotoresisti daha önce 4.4 adımında açıklandığı gibi geliştirin. 8. Altın biriktirme, kanal oluşumu ve kaynakların, drenajların ve kontrol kapılarının desenlerinin oluşturulması Metalin Parylene C’ye yapışıklıklarını teşvik etmek için substratları hafif bir plazma tedavisiyle (30 S’de 30 S) temizleyin ve termal evaporatörün vakum odasının içindeki substrat tutucuya yerleştirin. Potaya 30 mg altın yerleştirin, deklanşörü kapatın ve buharlaşma odasını 10-5 Torr’a ulaşana kadar pompalayın. Pota kırmızı parlayana kadar evaporatörun gücünü artırın ve 30 s bekleyin. Deklanşörü açın, gücü % 40’a çıkarın (veya pota parlak beyaz parlayana kadar), 60 s bekleyin, deklanşörü kapatın ve gücü kısın. Alt tabakaları fotoresisti çıkarmak için 10 s ultrasonik banyonun içindeki aseton kabına yerleştirin, böylece altını transistörlerin kanalından çıkarın. Substratları aseton, izopropil alkol ve su ile durulayın ve azotla kurulayın. Fotoresisti, 4.1 ve 4.2 adımlarının aynı parametrelerini kullanarak alt tabakalara yatırın. Cihazı bir bromografa yerleştirin ve istediğiniz kaynaklara, drenajlara ve kontrol kapısı düzenine sahip plastik bir fotolithografik maskeyi alt tabakaya yerleştirin. Üstten 1 dakika boyunca UV ışığına maruz durun ve maskeyi çizmemek için alt tabaka üzerindeki yanal hareketlerini en aza indirmeye dikkat ederek maskeyi dikkatlice çıkarın. Fotoresisti adım 4.4’te açıklandığı gibi geliştirin. Maruz kalan altını 10 sn boyunca altın aşındırma çözeltisi (adım 1.3) içine batırarak kazıyın, deiyonize suyla durulayın ve azot kullanarak kurutun. Alt tabakayı optik olarak inceleyin ve aseton kullanarak fotoresisti çıkarın. İzopropil alkol ve deiyonize su ile durulayın ve azotla kurulayın. 9. pH algılama için Parylene C’nin birikmesi ve etkinleştirilmesi Fotoresisti, 4.1 ve 4.2 adımlarının aynı parametrelerini kullanarak alt tabakalara yatırın. Cihazı bir bromografa yerleştirin ve OCMFET’lerin pH algılama alanlarına karşılık gelen açıklıklara sahip plastik bir fotolitografik maskeyi substratın üzerine yerleştirin. Üstten 1 dakika boyunca UV ışığına maruz durun ve maskeyi çizmemek için alt tabaka üzerindeki yanal hareketlerini en aza indirmeye dikkat ederek maskeyi dikkatlice çıkarın. Fotoresisti adım 4.4’te açıklandığı gibi geliştirin. pH algılama alanları hariç tüm cihazı poliimid yalıtım bandı ile koruyun ( Bkz. Malzeme Masası). Adım 5.1’de açıklanan parametreleri kullanarak alt tabakaya 500 nm Parylene C (1 g Parylene C dimer’e karşılık gelen) bir katman yatırın.NOT: pH algılama alanlarındaki toplam Parylene C kalınlığı 650 nm’dir. Bu ifade için silane gerekmez. Poliimid yalıtım bandını dikkatlice çıkarın. OCMFET’lerin pH algılama alanlarında Parylene C’yi etkinleştirmek için substratı oksijen plazmasına (5 dk ve 200 W’da 30 sn) maruz bırakın.NOT: Parylene C birikimini sınırlamak için poliimid yalıtım bandı burada gereklidir. Aslında, fotoresist kullanılarak basit bir kaldırma, Parylene C ile elde edilen konformsal kaplamanın neredeyse iğne deliği içermeyen doğası nedeniyle olumlu sonuçlar vermez. Fotoresisti tamamen çıkarmak için alt tabakaları ultrasonik banyo içinde bir aseton kabına 10 s yerleştirin. Substratları aseton ve izopropil alkol (su yok) ile durulayın ve azotla kurulayın. 10. Yarı iletken biriktirme, kültleme odası yerleştirme ve PET’ten cihazın son kesilmesi Substratları 50 °C’de sıcak bir tabağa yerleştirin. Her kanal alanına bir damlacık (1 μL) yarı iletken çözeltisi (adım 1.4) atın, tüm substratı bir kapakla örtün ve 30 dakika boyunca kimyasal bir davlumbaz altında kurumasına izin verin. 3D yazıcı ile iç yarıçapı 15 mm, kalınlığı 1 mm ve yüksekliği 7 mm olan akrilonitrile bütenin stiren halkasını bastırarak kült hazneyi hazırlayın. Kültleme odasını polidimetilsiloksan kullanarak substratın orta kısmına yapıştırın (kürleme maddesinin oranı: ağırlıkça% 15). Cihazı PET’ten manuel olarak veya lazer kesici kullanarak kesin. 11. Transistörlerin elektriksel karakterizasyonu Her transistörü bir kaynakmetre kullanarak karakterize edin18,19,20,21 (bkz. Malzeme Tablosu).NOT: Transistörlerin parametrelerini (özellikle taşıyıcıların hareketliliği, eşik voltajı, ION/IOFF oranı ve alt koruma eğimi) tahmin etmek için hem çıkış hem de giriş özellikleri ölçülmelidir.

Representative Results

MOA’nın potansiyeli burada hem elektriksel aktivite kayıtları hem de metabolik aktivite izleme için doğrulanmıştır. Cihazın hücre dışı eylem potansiyellerini tespit etme yeteneklerinin kesin tahmini, sıçan kardiyomiyosit kültürleri ile kapsamlı bir karakterizasyona dayanıyordu (özellikle 8 günlük in vitro [DIV])18 olarak ölçülen birincil sıçan kardiyomiyositlerinde). Şekil 3A , 16 OCMFET ile eksiksiz bir MOA göstermektedir. Üstteki inset, MOA yüzeyine bağlı bir konfluent sıçan kardiyomiyosit kültürü örneği gösterir. Sağlıklarını vurgulamak için, hücreler kayıt seansından sonra sarkolerik protein olan tropomyosin için immünostain edilmiştir. Alt içe doğru OCMFET ile ölçülen tek bir kardiyomiyosit sinyali gösterilir. İlginçtir ki, cihaz şekil 3B’de gösterildiği gibi spontan elektriksel aktiviteyi ve farklı kimyasalların verilmesi üzerine indüklenen aktiviteyi tespit edebilir. Bu doğrulama, elektrojenik hücre interfacing için bu yaklaşımı kullanmanın fizibilitesini göstermek için çok önemliydi. Dizi yapılandırması nedeniyle, MOA ayrıca kardiyak sinyalin yayılma hızının yeniden yapılandırılmasına izin verdi ve böylece sistemin hücresel ağların çalışmasına uygunluğunu gösterdi (Şekil 3C). Cihazın gerçek algılama sınırını belirlemek için daha fazla doğrulama için MOA, sinyal genliği ve kayıtların güvenilirliği açısından ilginç sonuçlarla striatal nöronlar (21 DIV)18 ile de test edildi. Şekil 3D’de görüldüğü gibi, OCMFET nöronal alan potansiyellerini dikkat çekici stabilite ile güçlendirebilir ve 3,2’ye kadar sinyal-gürültü oranları (SNRS) gösterebilir (standart MEAs25 ile elde edilen SNR’lerin aynı aralığında). Kayıt kurulumu, transistör sapma ve sinyal okuma ve koşullandırma için özel çok kanallı elektronikten oluşuyordu. Elektrik kaydı için her kanal, 1 MΩ geri besleme direncine sahip bir I/V dönüştürücü ve 110 voltaj kazancına sahip 150 Hz-1.3 kHz bandpass filtreden oluşan bir ilk aşamaya sahiptir. Sunulan tüm ölçümler için transistörler VDS = VGS = -1 V ile önyargılıydı. A/D dönüştürme ve veri görselleştirme ve depolama bir veri toplama panosu kullanılarak gerçekleştirildi (bkz. Malzeme Tablosu). Tüm ölçüm seansları, sistemdeki elektriksel, çevresel gürültüyü en aza indirmek için bir Faraday kafesi içinde gerçekleştirildi. Daha önce de belirtildiği gibi, protokolde sunulan basit fiziksel işlevselleştirmeden yararlanarak, süpernernstian bir yanıtla son derece hassas pH sensörleri hazırlamak mümkündü. Sunulan imalat yaklaşımı nedeniyle, bu pH cihazları bir MOA’ya entegre edilebilir ve birincil hipokampal sıçan nöronlarının metabolik aktivitesinin neden olduğu hafif pH varyasyonlarını izlemek için kullanılabilir26. Özellikle, Şekil 4’te gösterildiği gibi, düşük frekanslı algılamaya adanmış iki OCMFET’den sadece biri, yaklaşımın fizibilitesini göstermek için seçici olarak işlevselleştirildi. Bu seçici işlevselleştirme, iki OCMFET’nin kimyasal olarak indüklenen metabolik varyasyonlara yanıtının değerlendirilmesine izin verdi: özellikle, GABA A reseptörlerinin inhibitörü olan bikükülin (BIC) kullanılarak yüksek metabolik bir durum elde edilebilirken, sonunda hücresel ölüme neden olan tetrodotoksin (TTX) ilavesi ile düşük metabolik bir durum indüklenebilir28 . Kayıt kurulumu, elektronik etkinlik ölçümleri için kullanılan aynı özel çok kanallı elektronikten oluşuyordu. Önceki vakanın aksine, hücresel metabolik aktivitenin neden olduğu yavaş varyasyonları kaydetmek için iki özel kanal kullanılmıştır. Her kanal iki ana bloktan oluşan basit bir devreden oluşuyordu: 1 MΩ geri besleme direncine sahip bir I/V dönüştürücü ve 10 Hz kesme frekanslı düşük geçişli bir filtre. Transistörler VDS = VGS = -1 V ile önyargılıydı ve tüm ölçümler, dış gürültünün kayıtlar üzerindeki etkisini en aza indirmek için bir Faraday kafesi içinde gerçekleştirildi (bu, hücresel metabolik aktivitenin neden olduğu düşük akım dalgalanmaları göz önüne alındığında özellikle önemli bir husustur). Deneyler sırasında kültürler düşük tamponlu bir kültür ortamında sürdürüldü ve tüm sistem kontrollü bir ortama (37 °C ve sürekli co2/hava akısı) yerleştirildi. Beklendiği gibi, sadece pH’a duyarlı OCMFET akımı 25 μM BIC ilave edilerek modüle edilebilir. Bu, hücresel metabolik aktivitenin karşılık gelen varyasyonu ile mevcut varyasyonun indüksiyonu ile daha da doğrulandı. Aynı deney, hücresel metabolizmanın kademeli olarak yavaşlamasına neden olan 10 μM TTX’in eklenmesinden sonra tekrarlandı. TTX’in eklenmesinden sonra, ne pH’a duyarlı OCMFET ne de pH duyarsız olan herhangi bir yanıt göstermedi ve böylece yaklaşımın etkinliğini gösterdi. Bu sonuçlar, önerilen işlevselleştirmenin etkinliğini ve 2 haftaya kadar göreceli kararlılığını göstermektedir. Önerilen deneylerden (hem elektriksel aktivite hem de metabolik aktivite) çıkarılabilecek önemli bir sonuç, aynı kültleme alanında farklı OCMFET’leri seçici olarak işlevselleştirerek farklı sensör türlerini hazırlamanın mümkün olduğudur. Bu yön, hücresel uygulamalar için biyosensörlemede önemsiz olmayan bir başarıyı temsil eder, çünkü aynı hücre kültürü içindeki farklı parametreleri izleyebilmek, bu biyolojik sistemlerin karmaşıklığının daha iyi karakterizasyonu için çok önemlidir. Şekil 1: Elektroaktif hücrelerin metabolik ve elektriksel izlenmesi için 16 kanallı bir MOA’nın üst görünümü. Ölçek çubuğu = 1 cm. Kısaltmalar: OCMFET’ler = organik yük modüle edilmiş alan etkili transistörler; FG = yüzen kapı; S/D = kaynak/drenaj; MOA = mikro OCMFET dizisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Elektroaktif hücrelerin metabolik ve elektriksel izlenmesi için bir MOA’nın ana imalat adımları. (A ve B) Buharlaştırılmış Ti filmi, OCMFET’lerin yüzen kapısını hazırlamak için standart bir fotolitografik işlem kullanılarak desenlenir. (C) 15 nm Parylene C.’nin ifadesine istiraki. Bu tabaka, yerli Ti oksit ile birlikte transistörlerin kapı dielektrik görevi görür. (D ve E) Parylene C tabakası plazma oksijen tedavisi kullanılarak desenlenmiştir. Desenli bir fotoresist katman, elektrik kayıtları ve yüzen kapı arka kontakları için algılama alanlarını seçici olarak ortaya çıkarmak için kullanılır. (F) Au üst kontaklarının, yani kaynak, drenaj, kontrol kapısı ve yüzen kapı geri temasının deseni. Cihazın elektriksel performansını artırmak için kendi kendine hizalama tekniği kullanılır. (G-I) Parylene C’nin ikinci tabakasının metabolik aktivite izleme için OCMFET’lerin algılama alanında birikmesi. Oksijen plazmasına maruziyeti sonrasında bu tabaka pH’a duyarlı membran (J) görevi görecektir. (K) Organik yarı iletkenin (TIPS Pentacene) ve kültür odası konumlandırmasının birikmesinden sonra tam bir MOA’nın (malzemelerle) kesiti. Kısaltmalar: OCMFET’ler = organik yük modüle edilmiş alan etkili transistörler; FG = yüzen kapı; S/D = kaynak/drenaj; MOA = mikro OCMFET dizisi; CG = kontrol kapısı; PET = polietilen tereftalat; Par C = Parylene C; İpUÇLARI = 6,13-bis(triisopropylsilylethynyl) pentacene; ABS = akrilonitrile bütandien stiren. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Moa ile hücresel elektriksel aktivite kayıtları. (A) Bir MOA yüzeyine bağlı kalan, bir kayıt seansından sonra sabitlenen ve sarkolerik protein, tromomiyosin (üst inset) için bağışıklık sistemine sahip bir sıçan kardiyomiyosit kültürü (8 DIV). Alt inset: OCMFET ile ölçülen tek bir kardiyomiyosit sinyali örneği. Ölçek çubuğu = 150 μm. (B) Kardiyomiyosit kültürünün elektriksel aktivitesinin kimyasal ayarı. Aktivite ivmesi 100 mM norepinefrin ilavesinden, baskılama ise 100 mM verapamil eklenmesinden kaynaklanan bir nedenden dırmıştır. Sol: dayak frekans modülasyonu; sağ: 5 OCMFET ortalaması ve standart sapma istatistikleri: bazal 4 dakika (129 ± 4.6), norepinefrin aracılı (280 ± 28.6) ve verapamil aracılı aktivite (15 ± 1.9) üzerinde spike-count. (C) Kardiyak sinyalin yayılmasının yeniden yapılandırılması. Sağ: sinyalin site 14’ten site 41’e yayılmasını gösteren kültürün spontan aktivitesinin raster arsası (sağda). (D) Sıçan embriyosundan striatal hücrelerin etki potansiyelleri (21 DIV). Bu rakam 18’den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: OCMFET = organik yük modüle edilmiş alan etkili transistör; MOA = mikro OCMFET dizisi; NE = norepinefrin; VER = verapamil; DIV = gün içinde in vitro. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Moa ile metabolik aktivite kayıtları. Moa’nın (A) pH’a duyarlı ve (B) pH’a duyarsız kanallarının 10 μM TTX ilavesinden önce ve sonra 25 μM BIC eklenmesine yanıtı. TTX ilavesi sonrasında, pH’a duyarlı kanalın davranışı pH’a duyarlı olanınkine benzer hale gelir. Özellikle, TTX kaynaklı hücresel ölüm nedeniyle BIC ilavesi sonrasında akım varyasyonu gözlenememedir. (C) Metabolik aktivite kayıtları için MOA. pH’a duyarlı ve pH’a duyarsız OCMFET’ler sırasıyla yeşil ve kırmızı olarak özetlenmiştir. İç kısım: sağlıklı hipokampal nöronlar 15 DIV.Scale bar = 50 μm’den sonra cihaza kültüre edildi. Bu rakam 26’dan değiştirilmiştir. Kısaltmalar: OCMFET = organik yük modüle edilmiş alan etkili transistör; MOA = mikro OCMFET dizisi; BIC = bikükülin; TTX = tetrodotoksin; DIV = gün içinde in vitro. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Hücresel uygulamalar için OCMFET’lerin imalatı için önceki yöntemlerin aksine18,29, önerilen yöntem, aynı anda elektriksel ve metabolik hücresel aktiviteyi tespit edebilecek MOA’lar hazırlamak için özel olarak tasarlanmıştır. Ayrıca, pH duyarlılığı elde etmek için bu yaklaşım standart imalat protokolleriyle uyumlu olma avantajına sahiptir ve algılama alanının herhangi bir kimyasal modifikasyonunu içermez (bu yönü tüm cihazın biyouyumluluğunu sağlar). pH hassasiyeti, bir kapı dielektrik (yani biyouyumlu Parylene C) olarak kullanılan aynı malzeme kullanılarak elde edilir ve bu yaklaşım hızlı ve tekrarlanabilir hale getirilir.

Bu yaklaşımın nihai sonucu, in vitro hücresel uygulamalar için esnek, şeffaf, düşük maliyetli ve çok duyarlı bir organik araçtır. Bunun tek bir transistör yapısı kullanılarak elde edilebilmesi ve algılama alanının basit bir fiziksel modifikasyonu organik elektronik malzeme ve yöntemlerin kullanılmasının sağladığı avantajlara katkıda bulunur. Ayrıca, OCMFET’in transdüksiyon prensibi kesinlikle belirli yarı iletken veya FG malzemesine bağlı olmadığından, tüm işlem belirli uygulamaya bağlı olarak değiştirilebilir ve ölçeklendirilebilir.

Önerilen tekniğin kritik bir yönü plazma aktivasyon tekniğinin tekrarlanabilirliği ile ilgilidir. Tutarlı sonuçlar elde etmek için hem Parylene C kalınlığı hem de gravür oranı kontrol edilmelidir. Parylene C biriktirme işleminin ve plazma temizleyicinin sık kalibrasyonu kesinlikle gereklidir. Sürecin tekrarlanabilirliğine de katkıda bulunan diğer kritik hususlar, cihazın dikkatli bir şekilde işlenmesi ve organik yarı iletkenin birikmesidir. Burada basit bir damla döküm tekniği kullanıldı, bu da özünde tekrarlanabilirlik sınırlamaları oluşturuyor. Bu sorunları en aza indirmek için, protokol adım 10.1’de açıklandığı gibi, her seferinde aynı miktarda yarı iletken çözelti kullanılmalı ve çözücü buharlaştırma mümkün olduğunca standartlaştırılmalıdır. Sıcak bir plaka kullanarak sabit bir sıcaklık tutmak ve her damlacık birikiminden sonra substratı örtmek buharlaşma sürecini yavaşlatmaya yardımcı olacaktır. Bu sorunu daha da en aza indirmek için biriktirme tekniği (örneğin, mürekkep püskürtmeli yazdırma yöntemi kullanılarak) değiştirilebilir30.

Önerilen protokolün bir sınırlaması, pH algılama için OCMFET’nin işlevselleştirilmesinin doğasından kaynaklanmaktadır. pH sensörlerinin stabilitesi birkaç hafta ile sınırlıdır26. Bununla birlikte, önerilen yaklaşımın stabilite penceresi, nöronal kültür büyümesi için gereken standart kuluçka sürelerini (2-3 hafta) kapsayacak kadar büyüktür. Daha uzun deneyler için diğer algılama alanı fonksiyonelleştirme türleri göz önünde bulundurulmalıdır. İmalat protokolü, FG’lere elektrik erişimi sağlayan özel bir geri temas kullanır. Cihazın normal çalışması sırasında yüzer olarak bırakılan bu temas, cihazın elektriksel karakterizasyonu ve algılama alanlarının farklı teknikler (örneğin elektrodepozisyon) kullanılarak işlevselleştirilmesi için kullanılabilir.

Bu prosedür, geniş malzemelere veya temiz oda olanaklarına ihtiyaç duymadan hücresel uygulamalar için çok algılamalı bir cihaz hazırlamanın uygun bir yolunu temsil eder. Organik bir yarı iletkenin istihdamı ve algılama alanının fiziksel (kimyasal değil) işlevselleştirilmesi nedeniyle performans ve stabilite sınırlamalarına rağmen, hücresel biyoloji, doku mühendisliği ve nörobilim alanlarında araştırmacılara tüp bebek eğitimi için yeni özel araçlar sağlayabilen düşük maliyetli (ve potansiyel olarak tek kullanımlık), mekanik olarak esnek ve optik olarak şeffaf sensörler ve biyosensörler hazırlamak için benzer yaklaşımlar kullanılabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, 882897-Arama Kurtarma projesi ve PON projesi “TEX-STYLE” ARS01_00996, PNR 2015-2020 hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon sağlamayı kabul etmektedir.

Materials

3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich 440159
3D printer Makerbot Replicator 2x Makerbot https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros.
ABS filament
Anisole Sigma Aldrich 296295
Bromograph model Hellas Bungard https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros.
Gold Local seller
Hydrofluoric acid Sigma Aldrich 695068
Iodine Sigma Aldrich 207772
Kapton tape polyimide insulation tape
Laser cutter VLS2.30 Universal Laser Systems https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros.
Multichannel Systems acquisition board www.multichannelsystems.com
NaOH pellets Sigma Aldrich 567530
Parylene C dimer SCS special coating systems coating
PDMS Silgard 184 Sigma Aldrich 761036
PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System SCS special coating systems https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros
PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) Goodfellow ES301450
Petri dishes
Plasma cleaner Gambetti "Tucano" Gambetti https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros.
Positive photoresist AZ1518 MicroChemicals
Potassium iodide KI Sigma Aldrich 221945
Source Meter 2636 Keithley https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros
Spin coater unit Ossila https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros.
Stereoscopic microscope SMZ745T Nikon https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/. Estimated price: 2k-3k euros.
Thermal evaporator unit
TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) Sigma Aldrich 716006
Titanium wire Goodfellow TI005129
Ultrasonic bath Falc Instruments https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hubel, D. H. Tungsten microelectrode for recording from single units. Science. 125 (3247), 549-550 (1957).
  2. Verzeano, M., Negishi, K., Angeles, L. Neuronal activity in cortical and thalamic networks. A study with multiple microelectrodes. Journal of General Physiology. 43 (6), 177-195 (1960).
  3. Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74 (1), 61-66 (1972).
  4. Grattarola, M., Martinoia, S. Modeling the neuron-microtransducer junction: from extracellular to patch recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (1), 35-41 (1993).
  5. Wallace, K., Strickland, J. D., Valdivia, P., Mundy, W. R., Shafer, T. J. A multiplexed assay for determination of neurotoxicant effects on spontaneous network activity and viability from microelectrode arrays. NeuroToxicology. 49, 79-85 (2015).
  6. Bergveld, P. Development, operation, and application of the tool for electrophysiology. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 19 (5), 342-351 (1972).
  7. Bergveld, P., Wiersma, J., Meertens, H. Extracellular potential recordings by means of a field effect transistor without gate metal, called OSFET. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 23 (2), 136-144 (1976).
  8. Fromherz, P., Offenhausser, A., Vetter, T., Weis, J. A neuron-silicon junction: a Retzius cell of the leech on an insulated-gate field-effect transistor. Science. 252 (5010), 1290-1293 (1991).
  9. Martinoia, S., et al. Development of ISFET array-based microsystems for bioelectrochemical measurements of cell populations. Biosensors and Bioelectronics. 16 (9-12), 1043-1050 (2001).
  10. Heer, F., et al. CMOS microelectrode array for the monitoring of electrogenic cells. Biosensors and Bioelectronics. 20 (2), 358-366 (2004).
  11. Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab on a Chip. 9 (18), 2644-2651 (2009).
  12. Maccione, A., et al. Multiscale functional connectivity estimation on low-density neuronal cultures recorded by high-density CMOS micro electrode arrays. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 161-171 (2012).
  13. Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
  14. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Scientific Reports. 4, 5489 (2014).
  15. Zuo, L., Yu, S., Briggs, C. A., Kantor, S., Pan, J. Y. Design and fabrication of a three-dimensional multi-electrode array for neuron electrophysiology. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (12), (2017).
  16. Spanu, A., et al. A three-dimensional micro-electrode array for in-vitro neuronal interfacing. Journal of Neural Engineering. 17 (3), 036033 (2020).
  17. Spanu, A., Martines, L., Bonfiglio, A. Interfacing cells with organic transistors: a review of in vitro and in vivo applications. Lab on a Chip. 21 (5), 795-820 (2021).
  18. Spanu, A., et al. An organic transistor-based system for reference-less electrophysiological monitoring of excitable cells. Scientific Reports. 5, 8807 (2015).
  19. Viola, F. A., Spanu, A., Ricci, P. C., Bonfiglio, A., Cosseddu, P. Ultrathin, flexible and multimodal tactile sensors based on organic field-effect transistors. Scientific Reports. 8, 8073 (2018).
  20. Napoli, C., et al. Electronic detection of DNA hybridization by coupling organic field-effect transistor-based sensors and hairpin-shaped probes. Sensors. 18 (4), 990 (2018).
  21. Spanu, A., et al. A reference-less pH sensor based on an organic field effect transistor with tunable sensitivity. Organic Electronics. 48, 188-193 (2017).
  22. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
  23. Zhang, Y. S., et al. Multisensor-integrated organs-on-chips platform for automated and continual in situ monitoring of organoid behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2293-2302 (2017).
  24. Yu, H., et al. A novel design of multifunctional integrated cell-based biosensors for simultaneously detecting cell acidification and extracellular potential. Biosensors and Bioelectronics. 24 (5), 1462-1468 (2009).
  25. Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
  26. Spanu, A., Tedesco, M. T., Martines, L., Martinoia, S., Bonfiglio, A. An organic neurophysiological tool for neuronal metabolic activity monitoring. APL Bioengineering. 2 (4), 046105 (2018).
  27. Díaz-García, C. M., et al. Neuronal stimulation triggers neuronal glycolysis and not lactate uptake. Cell Metabolism. 26 (2), 361-374 (2017).
  28. Xie, Y., Dengler, K., Zacharias, E., Wilffert, B., Tegtmeier, F. Effects of the sodium channel blocker tetrodotoxin (TTX) on cellular ion homeostasis in rat brain subjected to complete ischemia. Brain Research. 652 (2), 216-224 (1994).
  29. Caboni, A., Orgiu, E., Barbaro, M., Bonfiglio, A. Flexible organic thin-film transistors for pH monitoring. IEEE Sensors Journal. 9 (12), 1963-1970 (2009).
  30. Fraboni, B., Bonfiglio, A., Basiricò, L. Inkjet printing of transparent, flexible, organic transistors. Thin Solid Films. 520, 1291-1294 (2011).

Tags

In VitroMultiparametricCellular AnalysisOrganic Charge-modulated Field-effect Transistor ArraysBiocompatibleMechanically CompliantLow CostElectrical ActivityMetabolic ActivityPersonalized MedicineNeurodegenerative DiseasesPET SubstrateTitanium DepositionPhotoresistSpin CoatingPhotolithographic MaskUV Exposure

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Spanu, A., Bonfiglio, A. In Vitro Multiparametric Cellular Analysis by Micro Organic Charge-modulated Field-effect Transistor Arrays. J. Vis. Exp. (175), e62907, doi:10.3791/62907 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image