في فيترو تحليل خلوي متعدد البارامترات بواسطة صفيفات ترانزستور ذات تأثير ميداني معدلة بواسطة Micro Organic
Summary
هنا، نقدم بروتوكول تصنيع جهاز ترنزستور (OCMFET) العضوي ذو التأثير الميداني المعدل للشحنة من أجل التشبيك الخلوي المختبري . الجهاز، ودعا مجموعة OCMFET الصغيرة، هو جهاز مرن ومنخفض التكلفة، وأقل مرجعا، والتي سوف تمكن من رصد الأنشطة الكهربائية والتمثيل الغذائي من ثقافات الخلايا الكهربائية.
Abstract
وقد غذت الفيزيولوجيا الكهربائية الحديثة باستمرار من خلال التطوير الموازي للأدوات والمواد المتطورة على نحو متزايد. وفي المقابل، أدت الاكتشافات في هذا المجال إلى إحراز تقدم تكنولوجي في عملية متتالية حددت في نهاية المطاف الإنجازات المثيرة للإعجاب التي تحققت في السنوات الخمسين الماضية. ومع ذلك ، فإن الأجهزة الأكثر استخداما المستخدمة في الاتصال الخلوي (أي صفائف microelectrode والأجهزة الإلكترونية الدقيقة المستندة إلى الترانزستورات) لا تزال تمثل العديد من القيود مثل التكلفة العالية ، وصلابة المواد ، ووجود قطب مرجعي خارجي. للتغلب جزئيا على هذه القضايا، كانت هناك تطورات في مجال علمي جديد يسمى الإلكترونيات الحيوية العضوية، مما أدى إلى مزايا مثل انخفاض التكلفة، ومواد أكثر ملاءمة، وتقنيات التصنيع المبتكرة.
وقد اقترح العديد من الأجهزة العضوية الجديدة مثيرة للاهتمام خلال العقد الماضي لواجهة مريحة مع ثقافات الخلايا. تعرض هذه الورقة بروتوكول تصنيع أجهزة للتشبيك الخلوي استنادا إلى الترانزستور الميداني المعدل للشحن العضوي (OCMFET). تجمع هذه الأجهزة، التي تسمى صفائف OCMFET الدقيقة (MOAs)، بين مزايا الإلكترونيات العضوية والسمات الغريبة ل OCMFET لإعداد أدوات شفافة ومرنة وأقل مرجعية يمكن من خلالها مراقبة كل من الأنشطة الكهربائية والتمثيل الغذائي لخلايا القلب والخلايا العصبية في المختبر ، مما يسمح بتقييم متعدد البارامتريات لنماذج الخلايا الكهربائية.
Introduction
في رصد الجسم الحي للخلايا الكهربائية، مثل الخلايا العصبية وخلايا القلب، يمثل نهجا صالحا وقويا في التطبيقات البحثية الأساسية للدماغ البشري، ودراسات الاتصال الوظيفي، والصيدلة، وعلم السموم. وتستند الأدوات المستخدمة عادة لهذه الدراسات أساسا على صفائف microelectrode (MEAs)1,2,3,4,5 وأجهزة ذات تأثير ميداني أكثر كفاءة وقوة (FEDs)6,7,8,9,10,11,12 . تسمح هاتان العائلتان من الأجهزة بمراقبة وتحفيز النشاط الكهربائي للخلايا العصبية وخلايا القلب في الوقت الفعلي وعادة ما تتميز بالقوة وسهولة الاستخدام والموثوقية. هذه الميزات تجعل MEAs وFEDs المعيار الذهبي للتطبيقات الكهربية، ويجري استخدامها حاليا لواجهة مع الثقافات الخلوية القياسية، شرائح الدماغ organotypic، و organoids ثلاثية الأبعاد13،14،15،16. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع وخصائصها المثيرة للإعجاب ، فإن MEAs و FEDs تمثل بعض القيود مثل التكلفة العالية ، وصلابة المواد ، ووجود قطب مرجعي ضخم عادة ، والذي يجب وضعه في بيئة القياس السائلة وضروري لتشغيل الأجهزة بشكل صحيح.
لاستكشاف حلول بديلة للتشبيك الخلوي ، تم استثمار الكثير من الجهد في العقد الماضي في دراسة الأجهزة الإلكترونية القائمة على المواد العضوية وتقنيات التصنيع المبتكرة17. من بين العديد من الأجهزة العضوية التي تمت دراستها لمعالجة القيود المذكورة أعلاه ، تم اقتراح ترانزستور عضوي غريب يسمى OCMFET مؤخرا كبديل صالح ل MEAs و FEDs18. بالإضافة إلى الميزات القياسية التي توفرها تقنية الإلكترونيات العضوية ، مثل المواد منخفضة التكلفة وتقنيات التصنيع ، والخصائص الميكانيكية والكيميائية المثلى ، والشفافية البصرية ، والتوافق البيولوجي ، يقدم OCMFET أيضا حساسية شحن عالية جدا (بسبب بنيته ذات البوابتين) دون الحاجة إلى قطب مرجعي خارجي. وعلاوة على ذلك، يتمتع هذا المستشعر العضوي بقدرة ملحوظة على استشعار مختلف المعلمات التحليلية/الفيزيائية، اعتمادا على التشغيل الوظيفي المحدد لمنطقة الاستشعار الخاصة به، والتي يتم فصلها عن منطقة الترانزستور19,20. يمكن استغلال كل هذه الميزات بشكل ملائم للحصول على معلمات مختلفة داخل ثقافة الخلوية. على وجه الخصوص ، بالإضافة إلى القدرة على الكشف عن النشاط الكهربائي العصبي / القلب ، فمن الممكن أيضا استغلال حساسية درجة الحموضة العالية للغاية التي يوفرها الهيكل المزدوج المسور الغريب ل OCMFET باستخدام وظيفية بدنية بسيطة21 لمراقبة الاختلافات الطفيفة في درجة الحموضة المحلية الناجمة عن النشاط الأيضي الخلوي بشكل موثوق.
في الخلايا المختبرية الاستشعار الحيوي، ورصد النشاط الأيضي الخلوي هو مؤشر قوي على حالة الثقافة، ويمكن استخدامها لتقييم الاستجابة الخلوية لمختلف المحفزات، مثل إدارة الأدوية والتحفيز الكهربائي22،23. وعلاوة على ذلك، في حالة محددة من التطبيقات العصبية، ورصد كل من الأنشطة الكهربائية والأيضية هو من أهمية كبيرة، لا سيما في علم الصيدلة وعلم السموم24. بهدف معالجة متطلبات الفيزيولوجيا الكهربية الحديثة في المختبر بشكل ملائم وفي الوقت نفسه تقديم جميع مزايا OCMFET ، تم مؤخرا تقديم جهاز يسمى Micro OCMFET Array (MOA). وزارة مكافحة الخلايا هو مجموعة OCMFET المستندة إلى مناطق الاستشعار المتخصصة المصممة خصيصا للتشبيك الخلوي المختبري ، مما يتيح التحليل متعدد البارامترات لثقافات الخلايا الكهربائية. وعلى وجه الخصوص، يوجد في قناتين من قنوات وزارة الرقابة مجالات استشعار أكبر لزيادة حساسيتهما إلى أقصى حد، ويمكن تشغيلهما بشكل انتقائي لرصد بارامترات محددة ذات أهمية، مثل الاختلافات في درجة الحموضة في الوسط الثقافي. OCMFETs الأخرى في الهيكل بمثابة أجهزة استشعار النشاط الكهربائي خارج الخلية. ويبين الشكل 1 هيكل قناة 16 وزارة الأبحاث. هذه القدرة، جنبا إلى جنب مع عدم وجود قطب مرجعي خارجي، يجعل وزارة شؤون الشؤون الخارجية أداة مثيرة جدا للاهتمام للتطبيقات في المختبر . يقدم هذا العمل بروتوكول التصنيع خطوة بخطوة لوزارة مكافحة الأمراض المتعددة الأمراض للكشف في المختبر عن الأنشطة الكهربائية والأيضية للخلايا العصبية وخلايا القلب. يوضح الشكل 2 خطوات التصنيع الرئيسية والمواد المستخدمة وبنية الجهاز.
Protocol
Representative Results
Discussion
على عكس الطرق السابقة لتصنيع OCMFETs للتطبيقات الخلوية18،29 ، تم تصميم الطريقة المقترحة خصيصا لإعداد MOAs التي يمكنها الكشف عن النشاط الخلوي الكهربائي والأيضي في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج لتحقيق حساسية درجة الحموضة له ميزة التوافق مع بروتوكولات التصنيع القياسية ولا ينطوي على أي تعديل كيميائي لمنطقة الاستشعار (يضمن هذا الجانب التوافق البيولوجي للجهاز بأكمله). يتم تحقيق حساسية الأسهاء باستخدام نفس المادة المستخدمة كبوابة عازلة (أي الباريلين C المتوافق بيولوجيا) ، مما يجعل هذا النهج سريعا وقابلا للاستنساخ.
والنتيجة النهائية لهذا النهج هي أداة عضوية مرنة وشفافة ومنخفضة التكلفة ومتعددة السن للتطبيقات الخلوية في المختبر . وحقيقة أنه يمكن الحصول على ذلك باستخدام بنية ترانزستور واحدة وتعديل مادي بسيط لمنطقة الاستشعار تضيف إلى المزايا التي يتيحها استخدام المواد والأساليب الإلكترونية العضوية. وعلاوة على ذلك، لأن مبدأ النقل من OCMFET لا يعتمد بشكل صارم على أشباه الموصلات محددة أو المواد FG، يمكن تعديل العملية برمتها والارتقاء بها اعتمادا على تطبيق معين.
وهناك جانب حاسم من التقنية المقترحة يرتبط بإعادة إنتاج تقنية تنشيط البلازما. للحصول على نتائج متسقة، يجب التحكم في كل من سمك باريلين C ومعدل النقش. المعايرة المتكررة لعملية ترسب باريلين C ومنظف البلازما ضرورية للغاية. الجوانب الحاسمة الأخرى، والتي تسهم أيضا في استنساخ العملية، هي التعامل الدقيق مع الجهاز وترسب أشباه الموصلات العضوية. تم استخدام تقنية بسيطة لإسقاط الصب هنا ، والتي تشكل في جوهرها قيود الاستنساخ. ولتقليل هذه المسائل إلى أدنى حد، كما هو موضح في الخطوة 10-1 من البروتوكول، ينبغي استخدام نفس الكمية من محلول أشباه الموصلات في كل مرة، وينبغي توحيد تبخر المذيبات قدر الإمكان. الحفاظ على درجة حرارة ثابتة باستخدام لوحة ساخنة وتغطي الركيزة بعد كل ترسب قطرة سوف يساعد في إبطاء عملية التبخر. ولتقليل هذه المشكلة إلى أدنى حد ممكن، يمكن تبديل تقنية الترسب (مثل استخدام أسلوب طباعة نافث للحبر) 30.
10- وينبع تقييد البروتوكول المقترح من طبيعة تشغيل نظام OCMFET لاستشعار الحموضة. يقتصر استقرار أجهزة استشعار الحموضة على بضعة أسابيع26. ومع ذلك ، فإن نافذة الاستقرار للنهج المقترح كبيرة بما يكفي لتغطية أوقات الحضانة القياسية اللازمة لنمو ثقافة الخلايا العصبية (2-3 أسابيع). وينبغي النظر في أنواع أخرى من وظائف منطقة الاستشعار للتجارب الأطول. يستخدم بروتوكول التصنيع جهة اتصال خلفية مخصصة ، مما يسمح بالوصول الكهربائي إلى FGs. ويمكن استغلال هذا الاتصال، الذي يترك عائما أثناء التشغيل العادي للجهاز، من أجل التوصيف الكهربائي للجهاز وتشغيل مناطق الاستشعار باستخدام تقنيات مختلفة (مثل وضع الأقطاب الكهربائية).
يمثل هذا الإجراء طريقة مريحة لإعداد جهاز استشعار متعدد للتطبيقات الخلوية دون الحاجة إلى مواد توسعية أو مرافق غرفة نظيفة. على الرغم من قيود الأداء والاستقرار بسبب استخدام أشباه الموصلات العضوية والتشغيل الفيزيائي (وليس الكيميائي) لمنطقة الاستشعار ، يمكن استخدام نهج مماثلة لإعداد أجهزة استشعار وأجهزة استشعار بيولوجية منخفضة التكلفة (ويمكن التخلص منها) ومرنة ميكانيكيا وشفافة بصريا ، والتي يمكن أن توفر للباحثين في البيولوجيا الخلوية وهندسة الأنسجة وعلم الأعصاب أدوات متخصصة جديدة لدراسة الأنظمة الخلوية في المختبر.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعترف المؤلفون بتمويل برنامج أفق 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاق المنحة رقم 882897-Search&,Rescue ومشروع PON “TEX-STYLE” ARS01_00996، PNR 2015-2020.
Materials
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
| 3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
| ABS filament | |||
| Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
| Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
| Gold | Local seller | ||
| Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
| Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
| Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
| Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
| Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
| NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
| Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
| PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
| PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
| PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
| Petri dishes | |||
| Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
| Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
| Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
| Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
| Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
| Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. |
|
| Thermal evaporator unit | |||
| TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
| Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
| Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |
References
- Hubel, D. H. Tungsten microelectrode for recording from single units. Science. 125 (3247), 549-550 (1957).
- Verzeano, M., Negishi, K., Angeles, L. Neuronal activity in cortical and thalamic networks. A study with multiple microelectrodes. Journal of General Physiology. 43 (6), 177-195 (1960).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74 (1), 61-66 (1972).
- Grattarola, M., Martinoia, S. Modeling the neuron-microtransducer junction: from extracellular to patch recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (1), 35-41 (1993).
- Wallace, K., Strickland, J. D., Valdivia, P., Mundy, W. R., Shafer, T. J. A multiplexed assay for determination of neurotoxicant effects on spontaneous network activity and viability from microelectrode arrays. NeuroToxicology. 49, 79-85 (2015).
- Bergveld, P. Development, operation, and application of the tool for electrophysiology. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 19 (5), 342-351 (1972).
- Bergveld, P., Wiersma, J., Meertens, H. Extracellular potential recordings by means of a field effect transistor without gate metal, called OSFET. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 23 (2), 136-144 (1976).
- Fromherz, P., Offenhausser, A., Vetter, T., Weis, J. A neuron-silicon junction: a Retzius cell of the leech on an insulated-gate field-effect transistor. Science. 252 (5010), 1290-1293 (1991).
- Martinoia, S., et al. Development of ISFET array-based microsystems for bioelectrochemical measurements of cell populations. Biosensors and Bioelectronics. 16 (9-12), 1043-1050 (2001).
- Heer, F., et al. CMOS microelectrode array for the monitoring of electrogenic cells. Biosensors and Bioelectronics. 20 (2), 358-366 (2004).
- Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab on a Chip. 9 (18), 2644-2651 (2009).
- Maccione, A., et al. Multiscale functional connectivity estimation on low-density neuronal cultures recorded by high-density CMOS micro electrode arrays. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 161-171 (2012).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Scientific Reports. 4, 5489 (2014).
- Zuo, L., Yu, S., Briggs, C. A., Kantor, S., Pan, J. Y. Design and fabrication of a three-dimensional multi-electrode array for neuron electrophysiology. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (12), (2017).
- Spanu, A., et al. A three-dimensional micro-electrode array for in-vitro neuronal interfacing. Journal of Neural Engineering. 17 (3), 036033 (2020).
- Spanu, A., Martines, L., Bonfiglio, A. Interfacing cells with organic transistors: a review of in vitro and in vivo applications. Lab on a Chip. 21 (5), 795-820 (2021).
- Spanu, A., et al. An organic transistor-based system for reference-less electrophysiological monitoring of excitable cells. Scientific Reports. 5, 8807 (2015).
- Viola, F. A., Spanu, A., Ricci, P. C., Bonfiglio, A., Cosseddu, P. Ultrathin, flexible and multimodal tactile sensors based on organic field-effect transistors. Scientific Reports. 8, 8073 (2018).
- Napoli, C., et al. Electronic detection of DNA hybridization by coupling organic field-effect transistor-based sensors and hairpin-shaped probes. Sensors. 18 (4), 990 (2018).
- Spanu, A., et al. A reference-less pH sensor based on an organic field effect transistor with tunable sensitivity. Organic Electronics. 48, 188-193 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Zhang, Y. S., et al. Multisensor-integrated organs-on-chips platform for automated and continual in situ monitoring of organoid behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2293-2302 (2017).
- Yu, H., et al. A novel design of multifunctional integrated cell-based biosensors for simultaneously detecting cell acidification and extracellular potential. Biosensors and Bioelectronics. 24 (5), 1462-1468 (2009).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Spanu, A., Tedesco, M. T., Martines, L., Martinoia, S., Bonfiglio, A. An organic neurophysiological tool for neuronal metabolic activity monitoring. APL Bioengineering. 2 (4), 046105 (2018).
- Díaz-García, C. M., et al. Neuronal stimulation triggers neuronal glycolysis and not lactate uptake. Cell Metabolism. 26 (2), 361-374 (2017).
- Xie, Y., Dengler, K., Zacharias, E., Wilffert, B., Tegtmeier, F. Effects of the sodium channel blocker tetrodotoxin (TTX) on cellular ion homeostasis in rat brain subjected to complete ischemia. Brain Research. 652 (2), 216-224 (1994).
- Caboni, A., Orgiu, E., Barbaro, M., Bonfiglio, A. Flexible organic thin-film transistors for pH monitoring. IEEE Sensors Journal. 9 (12), 1963-1970 (2009).
- Fraboni, B., Bonfiglio, A., Basiricò, L. Inkjet printing of transparent, flexible, organic transistors. Thin Solid Films. 520, 1291-1294 (2011).
