عزل النوى من كلية الفأر البالغة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل النوى عالية الجودة من كلى الفئران المجمدة التي تعمل على تحسين تمثيل أنواع خلايا الكلى النخاعية وتجنب آثار التعبير الجيني من تفكك الأنسجة الأنزيمية.
Abstract
تنظم الكليتان العمليات الحيوية المتنوعة مثل الماء والكهارل والاتزان الداخلي الحمضي القاعدي. يتم تنفيذ الوظائف الفسيولوجية للكلية من خلال أنواع متعددة من الخلايا مرتبة في بنية معقدة عبر المحور القشري النخاعي للعضو. أدت التطورات الحديثة في علم النسخ أحادي الخلية إلى تسريع فهم التعبير الجيني الخاص بنوع الخلية في فسيولوجيا الكلى والمرض. ومع ذلك ، فإن بروتوكولات تفكك الأنسجة القائمة على الإنزيم ، والتي تستخدم بشكل متكرر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) ، تتطلب في الغالب أنسجة جديدة (غير مؤرشفة) ، وتقدم استجابات إجهاد النسخ ، وتفضل اختيار أنواع الخلايا الوفيرة من قشرة الكلى مما يؤدي إلى نقص تمثيل خلايا النخاع.
هنا ، نقدم بروتوكولا يتجنب هذه المشاكل. يعتمد البروتوكول على عزل النوى عند 4 درجات مئوية من أنسجة الكلى المجمدة. يتم عزل النوى من قطعة مركزية من كلية الفأر تتكون من القشرة والنخاع الخارجي والنخاع الداخلي. هذا يقلل من التمثيل المفرط للخلايا القشرية النموذجية لعينات الكلى الكاملة لصالح الخلايا النخاعية بحيث تمثل البيانات المحور القشري النخاعي بأكمله بوفرة كافية. البروتوكول بسيط وسريع وقابل للتكيف ويوفر خطوة نحو توحيد النسخ أحادي النوى في أبحاث الكلى.
Introduction
تعرض الكلى بنية أنسجة معقدة للغاية. وهي تتكون من أجزاء متميزة وظيفيا وتشريحيا على طول محور قشري ووظائف بيولوجية وسيطة ، مثل تنظيم حجم السائل خارج الخلية ، أو توازن الكهارل ، أو التوازن الحمضيالقاعدي 1.
مكنت التطورات في علم النسخ أحادي الخلية من التوصيف المتعمق للأنسجة المعقدة وتسريع فهم التعبير الجيني الخاص بنوع الجزء والخلية في فسيولوجيا الكلى والتطور والمرض2،3،4.
ومع ذلك ، فإن بروتوكولات التفكك القائمة على الإنزيم والتي يتم استخدامها بشكل متكرر ل scRNA-seq تظهر العديد من العيوب والقيود. اعتمادا على البروتوكول ، فإنها تولد استجابات الإجهاد النسخي وتحيز تفكك الأنسجة نحو أنواع الخلايا القشرية الأسهل في الانفصال 5,6. على الرغم من أن البروتوكولات التي تستخدم البروتياز النشط على البارد للكلى الجنينية قادرة على التخفيف من التغيرات النسخية المرتبطة بالإجهاد ، إلا أنها تفشل في التغلب على تحيز التفكك تجاه الخلايا القشرية وقد لا تكون قابلة للتكيف بسهولة مع أنواع مختلفة من أنسجة الكلى المريضة7. بالإضافة إلى ذلك ، لا تتوافق مناهج الخلية الواحدة بسهولة مع عينات الأنسجة المجمدة ، مما يحد من تطبيقها في الغالب على الأنسجة الطازجة غير المؤرشفة ، مما يجعل جمع الأنسجة عاملا مقيدا6.
يمكن لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى (snRNA-seq) التحايل على هذه القيود 8,9. هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل النوى من شريحة مركزية من أنسجة كلى الفئران البالغة المجمدة (الشكل 1)10. بروتوكولنا بسيط ويوفر نهجا موحدا للحصول على مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي مع تمثيل متوازن لأنواع خلايا الكلى المتنوعة للنماذج التجريبية التي لا تنطوي على تغييرات قوية في الأنسجة الإقليمية. في الحالة الأخيرة ، يمكن أيضا إجراء بروتوكولنا بالكلى الكاملة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعمل النسخ أحادية الخلية على تعزيز فهم التعبير الجيني الخاص بنوع الخلية في فسيولوجيا الكلى والمرض. هنا ، قدمنا طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لعزل النوى المفردة عالية الجودة من أنسجة كلى الفئران المجمدة ل snRNA-seq بطريقة موحدة.
بالنسبة إلى snRNA-seq ، من الأهمية بمكان استخدام نوى عالية الجودة كمدخلات لتوليد المكتبة وتجنب تدهور الحمض النووي الريبي أثناء معالجة الأنسجة. لذلك ، فإن حضانة قطع الأنسجة في محلول تثبيت الحمض النووي الريبي مباشرة بعد التشريح أمر ضروري لحماية واستقرار الحمض النووي الريبي الخلوي ويسمح بتخزين العينات عند – 80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. عند تطبيق هذا البروتوكول على الأنسجة المجمدة دون معالجة محلول تثبيت الحمض النووي الريبي ، مثل المواد الأرشيفية ، يلزم إجراء اختبار تجريبي ، ويجب تقييم جودة الحمض النووي الريبي حيث لاحظنا خسارة كبيرة في سلامة الحمض النووي الريبي في الأنسجة المجمدة المفاجئة دون حضانة مسبقة في محلول تثبيت الحمض النووي الريبي.
بشكل عام ، تعد المعالجة المناسبة للعينات أمرا بالغ الأهمية لتحقيق أقصى قدر من استعادة النوى المفردة السليمة. يجب تنفيذ جميع خطوات إعادة التعليق عن طريق السحب بعناية لتجنب إجهاد القص والأضرار المادية. يجب أن تحتوي المخازن المؤقتة لإعادة تعليق النوى النهائية وفرز النوى على BSA لتجنب فقدان النوى وتجميعها.
تم تحسين أحجام المخزن المؤقت في هذا البروتوكول لعينات الأنسجة الصغيرة جدا (~ 15 ملغ). من الأهمية بمكان ضمان تحلل الخلايا بالكامل والغسيل الكافي لتوليد معلقات عالية الجودة. ستؤدي كتل الأنسجة الكبيرة أو عينات الكلى الكاملة إلى تركيزات مفرطة من النوى تؤدي إلى التكتل والتجميع ، ووفرة عالية من الحمض النووي الريبي المحيط ، وجودة تعليق رديئة بشكل عام. إذا تمت معالجة عينات أكبر أو أنسجة أخرى ، يوصى بشدة بإجراء عمليات تجريبية لتحديد أحجام المخزن المؤقت المثلى للحد الأدنى من مستويات الحمض النووي الريبي المحيطة. يجب فحص جودة وتركيزات النوى والحمض النووي الريبي بعناية لأن التحميل الزائد يؤدي إلى ضعف الأداء بشكل عام.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن كميات كبيرة من حطام الخلايا ، مما يتسبب في مستويات عالية من الحمض النووي الريبي المحيط غير المرتبط بنواة واحدة يؤثر سلبا على نتائج التسلسل. إن توضيح تعليق النوى عن طريق الطرد المركزي من خلال وسادة السكروز يخفف من هذه المشكلة إلى حد ما ، ولكنه يمكن أن يؤدي أيضا إلى التحيز في تمثيل نوع الخلية عن طريق الاختيار المضاد مقابل النوى الكثيفة والصغيرة الموجودة ، على سبيل المثال ، في الخلايا المناعية16. إذا كان هذا مصدر قلق ، فيجب حذف تدرج السكروز. على النقيض من ذلك ، وجدنا أن قياس التدفق الخلوي القائم على تلطيخ DAPI كان أمرا بالغ الأهمية لتقليل كمية حطام الخلايا من أجل إنتاج تعليق أحادي النواة عالي الجودة.
يتمتع عزل النوى المفردة بمزايا كبيرة عند مقارنته بنهج الخليةالواحدة 8. إنه متوافق مع الأنسجة المجمدة بشكل صحيح ، مما يجعل جمع الأنسجة أكثر مرونة ، ويتحايل على الحاجة إلى تفكك الأنسجة القائم على الإنزيم ، والذي يمكن أن يؤدي إلى استجابات الإجهاد النسخي 6,17. علاوة على ذلك ، فإنه يتغلب على تحيز التفكك الذي يفضل اختيار أنواع الخلايا القابلة للانفصال بسهولة في القشرة الكلوية ، مما قد يؤدي إلى نقص تمثيل أنواع الخلايا النخاعية في بعض الأساليب القائمة على الإنزيم5،6،10.
إن استخدام قطعة الكلى المركزية بدلا من أنسجة الكلى الكاملة يوفر الموارد ويصحح التمثيل المفرط لأنواع الخلايا الوفيرة كما هو موضح سابقا10. ومع ذلك ، اعتمادا على نموذج الماوس أو النمط الظاهري الذي تم فحصه ، قد يكون من المفيد استخدام عينات الكلى الكاملة بدلا من شريحة متوسطة واحدة. قد تكون عينات الكلى الكاملة أكثر تمثيلا لنسب الخلايا الحقيقية ، أو التغيرات التي تحدث في الكلية بأكملها ، في حين أثبتت الشريحة الوسطى المشذبة أنها مفيدة للأنماط الظاهرية النخاعية أو عندما تكون مادة العينة محدودة. لذلك ، فإن هذا القرار خاص جدا بالمستخدم ويجب النظر فيه بعناية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر منصة علم الجينوم العلمية في مركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي في جمعية هيلمهولتز ، برلين على الدعم الفني.
تم دعم JL و KMSO من قبل مجموعة التدريب البحثي GRK 2318 التابعة لمؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) ووحدة الأبحاث FOR 2841. تم دعم KMSO من خلال منحة البحوث التعاونية 1365. تم دعم AB بتمويل من جائزة جوتفريد فيلهلم لايبنتز من DFG الممنوحة إلى NR.
Materials
| Cell sorter | – | – | For fluorescence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000015 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | Needs to contain DAPI light cube to count nuclei. Alternatively, nuclei can be counted manually under fluorescence microscope. |
| 4′,6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) | Biotrend | 40043/b | Stock solution prepared with a concentration of 100 µM. Used for nuclei staining in a final concentration of 2 µM. |
| D(+)-Sucrose ≥99.9%, ultrapure DNAse-, RNAse-free | VWR | 0335-500G | |
| DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22431021 | |
| Ethanol, 70 % | – | – | |
| FACS tubes | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma-Aldrich | D8938-1SET | |
| Minisart Syringe Filters 0.2 µm | Sartorius | 16534-GUK | |
| Nuclease-free Water | Invitrogen | AM9937 | |
| Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit | Sigma-Aldrich | NUC-101 | Nuclei EZ Lysis Buffer (Product No. N3408) needed for buffer preparation. |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X without calcium or magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Petri dishes, polystyrene 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| pluriStrainer Mini 100 µm | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| pluriStrainer Mini 20 µm | pluriSelect | 43-10020-40 | |
| pluriStrainer Mini 40 µm | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| Polystyrene Centrifuge Tube (15 mL) | Falcon | 352099 | |
| Razor blades | – | – | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | EO0384 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | Follow manufacturer's instructions (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Upon use the 200 mM stock solution is reconstituted to a green-black clear solution by incubating at 65 °C. |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | |
| RNase AWAY | Fisher Scientific | 11952385 |
References
- Thomas, R. S. Kidney modeling and systems physiology. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 1 (2), 172-190 (2009).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Park, J., Liu, C. L., Kim, J., Susztak, K. Understanding the kidney one cell at a time. Kidney International. 96 (4), 862-870 (2019).
- Clark, A. R., Greka, A. The power of one: advances in single-cell genomics in the kidney. Nature Reviews Nephrology. 16 (2), 73-74 (2020).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Muto, Y., et al. Single cell transcriptional and chromatin accessibility profiling redefine cellular heterogeneity in the adult human kidney. Nature Communications. 12 (1), 2190 (2021).
- Hinze, C., et al. Kidney single-cell transcriptomes predict spatial corticomedullary gene expression and tissue osmolality gradients. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (2), 291 (2021).
- Berger, S. L. Isolation of cytoplasmic RNA: ribonucleoside-vanadyl complexes. Methods in Enzymology. 152, 227-234 (1987).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease. Science. 360 (6390), 758-763 (2018).
- Kirita, Y., Wu, H., Uchimura, K., Wilson, P. C., Humphreys, B. D. Cell profiling of mouse acute kidney injury reveals conserved cellular responses to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15874-15883 (2020).
- Schneeberger, S., et al. The neuroinflammatory interleukin-12 signaling pathway drives Alzheimer’s disease-like pathology by perturbing oligodendrocyte survival and neuronal homeostasis. bioRxiv. , 441313 (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
