استخدام التغيرات في انتقال الأوراق للتحقيق في حركة البلاستيدات الخضراء في أرابيدوبسيس ثاليانا
Summary
تقوم العديد من الأنواع النباتية بتغيير موضع البلاستيدات الخضراء لتحسين امتصاص الضوء. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام أداة مباشرة مبنية في المنزل للتحقيق في حركة البلاستيدات الخضراء في أوراق أرابيدوبسيس ثاليانا باستخدام التغيرات في انتقال الضوء عبر ورقة كوكيل.
Abstract
وقد ثبت أن حركة البلاستيدات الخضراء في الأوراق تساعد على تقليل تثبيط الضوء وزيادة النمو في ظل ظروف معينة. يمكن تعلم الكثير عن حركة البلاستيدات الخضراء من خلال دراسة وضع البلاستيدات الخضراء في الأوراق باستخدام المجهر الفلوري البؤري على سبيل المثال ، ولكن الوصول إلى هذا النوع من الفحص المجهري محدود. يصف هذا البروتوكول طريقة تستخدم التغيرات في انتقال الأوراق كبديل لحركة البلاستيدات الخضراء. إذا تم نشر البلاستيدات الخضراء من أجل تحقيق أقصى قدر من اعتراض الضوء ، فسيكون الإرسال منخفضا. إذا تحركت البلاستيدات الخضراء نحو جدران الخلايا المضادة للكلينا لتجنب الضوء ، فسيكون الانتقال أعلى. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام أداة مباشرة مبنية في المنزل لتعريض الأوراق لكثافة الضوء الأزرق المختلفة وتحديد التغيرات الديناميكية في انتقال الأوراق. يسمح هذا النهج للباحثين بوصف حركة البلاستيدات الخضراء كميا في الأنواع والطفرات المختلفة ، ودراسة آثار المواد الكيميائية والعوامل البيئية عليها ، أو فحص الطفرات الجديدة ، على سبيل المثال ، لتحديد المكونات المفقودة في العملية التي تؤدي من إدراك الضوء إلى حركة البلاستيدات الخضراء.
Introduction
الضوء ضروري لعملية التمثيل الضوئي ونمو النبات وتطوره. إنه أحد أكثر العوامل اللاأحيائية ديناميكية حيث لا تتغير شدة الضوء على مدار الموسم أو اليوم فحسب ، بل تتغير أيضا بسرعة وبطرق لا يمكن التنبؤ بها اعتمادا على الغطاء السحابي. على مستوى الأوراق ، تتأثر شدة الضوء أيضا بكثافة وطبيعة النباتات المحيطة ومظلة النبات الخاصة. إحدى الآليات المهمة التي تسمح للنباتات بتحسين اعتراض الضوء في ظل ظروف الإضاءة المتغيرة هي قدرة البلاستيدات الخضراء على التحرك استجابة لمحفزات الضوء الأزرق1,2. في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة ، تنتشر البلاستيدات الخضراء عموديا على الضوء (على طول جدران الخلايا حول الخيطية) في ما يسمى باستجابة التراكم ، مما يزيد من اعتراض الضوء وبالتالي التمثيل الضوئي. في ظل ظروف الإضاءة العالية ، تتحرك البلاستيدات الخضراء نحو جدار الخلية المضاد للخلين في ما يسمى استجابة التجنب ، مما يقلل من اعتراض الضوء وخطر التثبيط الضوئي. في العديد من الأنواع ، تفترض البلاستيدات الخضراء أيضا وضعا مظلما محددا ، والذي يختلف عن مواقع التراكم والتجنب وغالبا ما يكون وسيطا بين هذين الاثنين3,4. أظهرت دراسات مختلفة أن حركة البلاستيدات الخضراء ليست مهمة فقط لتحمل الإجهاد على المدى القصير للأوراق5،6،7 ، ولكن أيضا لنمو النباتات ونجاحها التناسلي ، خاصة في ظل ظروف الإضاءة المتغيرة8،9.
يتم ملاحظة حركة البلاستيدات الخضراء بسهولة في الوقت الفعلي في بعض العينات الحية (على سبيل المثال ، الطحالب أو النباتات ذات الأوراق الرقيقة مثل Elodea) باستخدام المجهر الضوئي1. ومع ذلك، تتطلب دراسة حركة البلاستيدات الخضراء في معظم الأوراق معالجة مسبقة للحث على حركة البلاستيدات الخضراء، والتثبيت الكيميائي، وإعداد المقاطع العرضية قبل عرض العينات تحت المجهر الضوئي10. مع إدخال المجهر الليزري البؤري ، أصبح من الممكن أيضا تصوير الترتيب ثلاثي الأبعاد للبلاستيدات الخضراء في أوراق سليمة أو ثابتة4،11،12. تساعد تقنيات التصوير هذه بشكل كبير على فهم حركة البلاستيدات الخضراء من خلال توفير معلومات نوعية مهمة. ومن الممكن أيضا تحديد موضع البلاستيدات الخضراء كميا (كنسبة مئوية من البلاستيدات الخضراء في المواضع حول اللينة أو المضادة للكلينا في هذه الصور أو النسبة المئوية للمساحة التي تغطيها البلاستيدات الخضراء لكل سطح خلية كلية) ولكنه يستغرق وقتا طويلا، خاصة إذا تم إجراؤه على الفترات الزمنية اللازمة لالتقاط التغيرات السريعة في تحديد المواقع10,8 . إن أبسط طريقة لإظهار ما إذا كانت الأوراق المتكيفة مع الظلام من نوع معين أو الطفرات قادرة على حركة البلاستيدات الخضراء في استجابة التجنب هي تغطية معظم مساحة الورقة للحفاظ على البلاستيدات الخضراء في الظلام مع تعريض شريط من الورقة للضوء العالي. بعد ما لا يقل عن 20 دقيقة من التعرض العالي للضوء ، ستكون البلاستيدات الخضراء في المنطقة المكشوفة قد انتقلت إلى وضع التجنب ، وسيكون الشريط المكشوف أخف لونا بشكل واضح من بقية الورقة. وينطبق هذا على النوع البري A. thaliana ولكن ليس على بعض طفرات حركة البلاستيدات الخضراء الموصوفة بمزيد من التفصيل لاحقا13. هذه الطريقة والتعديلات عليها (على سبيل المثال ، عكس أجزاء الورقة المكشوفة ، وتغيير شدة الضوء) مفيدة لفحص أعداد كبيرة من المتحورات وتحديد الطفرات الخالية التي تفتقر إما إلى القدرة على إظهار استجابة تجنب أو تراكم أو كليهما. ومع ذلك ، فإنه لا يوفر معلومات حول التغيرات الديناميكية في حركة البلاستيدات الخضراء.
وعلى النقيض من ذلك، تسمح الطريقة الموصوفة هنا بتحديد كمية حركة البلاستيدات الخضراء في الأوراق السليمة باستخدام التغيرات في انتقال الضوء عبر الورقة كبديل لحركة البلاستيدات الخضراء الشاملة: في ظل الظروف التي تنتشر فيها البلاستيدات الخضراء في خلايا الميزوفيل في استجابة التراكم، ينتقل ضوء أقل عبر الورقة مما هو عليه عندما تكون العديد من البلاستيدات الخضراء في استجابة تجنبية، وضع أنفسهم على طول جدران الخلايا المضادة للكلينا. وبالتالي، يمكن استخدام التغيرات في الإرسال كبديل لحركة البلاستيدات الخضراء الشاملة في الأوراق14. ويرد وصف لتفاصيل الصك في مكان آخر (انظر الملف التكميلي)، ولكن في الأساس، يستخدم الصك الضوء الأزرق لتحريك البلاستيدات الخضراء ويقيس مقدار الضوء الأحمر الذي ينتقل عبر تلك الورقة على فترات زمنية محددة. في الآونة الأخيرة ، تم وصف تعديل لهذا النظام ، والذي يستخدم قارئا صغيرا معدلا بسعة 96 بئرا ، ومصباح LED أزرق ، وجهاز كمبيوتر ، وحاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها15.
وقد ساعد خيار استخدام مجموعة من الأساليب، بما في ذلك التقييم البصري للأوراق للفحص، يليه قياس التغيرات الديناميكية في انتقال العدوى واستخدام الفحص المجهري، إلى حد كبير على فهمنا لكل من الآليات الأساسية والأهمية الفسيولوجية/الإيكولوجية لحركة البلاستيدات الخضراء. على سبيل المثال ، أدى ذلك إلى اكتشاف وتوصيف مختلف المتحورات ، والتي تضعف في جوانب محددة من تحركاتها. على سبيل المثال ، تفتقر طفرات A. thaliana phot 1 إلى القدرة على تراكم البلاستيدات الخضراء في الإضاءة المنخفضة ، في حين تفتقر طفرات phot 2 إلى القدرة على إجراء تفاعل تجنب. ترجع هذه الأنماط الظاهرية إلى ضعف في مستقبلين للضوء الأزرق لكل منهما16،17،18. وعلى النقيض من ذلك، تفتقر طفرات chup1 إلى القدرة على تكوين خيوط الأكتين المناسبة حول البلاستيدات الخضراء الضرورية لنقل البلاستيدات الخضراء إلى الموضع المطلوب داخل الخلية11,19. بالإضافة إلى الدراسات المتحورة ، قام الباحثون بتقييم آثار المثبطات المختلفة على حركة البلاستيدات الخضراء لتوضيح الجوانب الميكانيكية للعملية. على سبيل المثال ، تم استخدام مواد كيميائية مثل H2O2 ومضادات الأكسدة المختلفة للتحقيق في آثار جزيء الإشارة هذا على حركة البلاستيدات الخضراء20. تم استخدام مثبطات مختلفة لتوضيح دور الكالسيوم في حركة البلاستيدات الخضراء21. بالإضافة إلى المساعدة في الكشف عن آليات حركة البلاستيدات الخضراء ، يمكن استخدام هذه الطرق لمقارنة حركة البلاستيدات الخضراء في مختلف الأنواع أو الطفرات المزروعة في ظروف مختلفة في محاولة لفهم السياق البيئي والتطوري لهذا السلوك. على سبيل المثال ، فقد تبين أن مدى تأثيرات الطفرات المختلفة في مسار حركة البلاستيدات الخضراء يعتمد على ظروف النمو7,9 ، وأن النباتات المتكيفة مع الشمس لا يبدو أنها تحرك البلاستيدات الخضراء الخاصة بها كثيرا. في المقابل ، الحركة مهمة جدا لنباتات الظل10،22،23.
تصف ورقة الأساليب هذه، التي تركز على المصنع النموذجي A. thaliana، كيفية استخدام جهاز إرسال وهو نسخة محدثة من أداة تم تطويرها مسبقا9. على الرغم من أن هذه الأداة غير متوفرة تجاريا ، إلا أن الأشخاص الذين لديهم فهم أساسي للإلكترونيات أو مساعدة من زملاء وطلاب الهندسة أو الفيزياء سيكونون قادرين على بناء الأداة باستخدام أجزاء بأسعار معقولة واتباع التعليمات التفصيلية (انظر الملف التكميلي). وتتمتع المنصة مفتوحة المصدر المستخدمة لبناء الأداة بدعم واسع النطاق على شبكة الإنترنت ومنتدى مجتمعي يقدم المساعدة في حالة ظهور مشاكل24.
يركز البروتوكول على كيفية استخدام الأداة لتحديد التغيرات في انتقال الأوراق في تشغيل استكشافي قياسي يعرض الورقة لمجموعة واسعة من ظروف الإضاءة ويلتقط تفاعلات الظلام والتراكم والتجنب ل A. thaliana. يمكن تعديل هذه الأشواط اعتمادا على الهدف من التجربة ويمكن استخدامها مع معظم الأنواع النباتية. تقدم الورقة أمثلة على بيانات انتقال النمط البري A. thaliana والعديد من الطفرات وتوضح كيفية إجراء مزيد من التحليل للبيانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجهاز سهل الاستخدام للغاية ولكن من الأهمية بمكان معايرة كل إعداد مشبك ورقة لجهاز الإرسال بشكل مستقل لأن تحديد موضع مصابيح LED والترانزستورات الضوئية قد يختلف قليلا من مشبك ورقة إلى آخر. تأكد من إدخال مصابيح LED والترانزستورات الضوئية بثبات وأعد التحقق من المعايرة إذا بدت البيانات متوقفة. ت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل من خلال جائزة Fiske وجائزة Wellesley College College College.
Materials
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
References
- Senn, G. . Die Gestalts- und Lageveränderung der Pflanzenchromatophoren. , (1908).
- Zurzycki, J. The influence of chloroplast displacements on the optical properties of leaves. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 30, 503-527 (1961).
- Wada, M., Kagawa, T., Sato, Y. Chloroplast movement. Annual Review of Plant Biology. 54, 455-468 (2003).
- Wada, M. Chloroplast movement. Plant Science. 210, 177-182 (2013).
- Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., Suetsugu, N., Miyao, M., Wada, M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. Nature. 420, 829-832 (2002).
- Davis, P. A., Hangarter, R. P. Chloroplast movement provides photoprotection to plants by redistributing PSII damage within leaves. Photosynthesis Research. 112, 153-161 (2012).
- Howard, M. M., Bae, A., Königer, M. The importance of chloroplast movement, nonphotochemical quenching, and electron transport rates in light acclimation and tolerance to high light in Arabidopsis thaliana. American Journal of Botany. 106 (11), 1-10 (2019).
- Gotoh, E., et al. Chloroplast accumulation response enhances leaf photosynthesis and plant biomass production. Plant Physiology. 178, 1358-1369 (2018).
- Howard, M. M., Bae, A., Pirani, Z., Van, N., Königer, M. Impairment of chloroplast movement reduces growth and delays reproduction of Arabidopsis thaliana in natural and controlled conditions. American Journal of Botany. 107 (9), 1309-1318 (2020).
- Trojan, A., Gabryś, H. Chloroplast distribution in Arabidopsis thaliana (L.) depends on light conditions during growth. Plant Physiology. 111, 419-425 (1996).
- Oikawa, K., et al. Chloroplast unusual positioning is essential for proper chloroplast positioning. The Plant Cell. 15, 2805-2815 (2003).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Kagawa, T., et al. Arabidopsis NPL1: a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response. Science. 291, 2138-2141 (2001).
- Berg, R., et al. A simple low-cost microcontroller-based photometric instrument for monitoring chloroplast movement. Photosynthesis Research. 87, 303-311 (2006).
- Johansson, H., Zeidler, M. Automatic chloroplast movement analysis. Molecular Biology. 1398, 29-35 (2016).
- Briggs, W. R., et al. The phototropin family of photoreceptors. Plant Cell. 13, 993-997 (2001).
- Jarillo, J. A., et al. Phototropin-related NPL1 controls chloroplast relocation induced by blue light. Nature. 410, 952-954 (2001).
- Sakai, T. Arabidopsis nph1 and npl1: blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 98 (12), 6969-6974 (2001).
- Wada, M., Kong, S. -. G. Actin-mediated movement of chloroplasts. Journal of Cell Science. 131, 1-8 (2018).
- Wen, F., Xing, D., Zhang, L. Hydrogen peroxide is involved in high blue light-induced chloroplast avoidance movements in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 59 (10), 2891-2901 (2008).
- Tlalka, M., Fricker, M. The role of calcium in blue-light dependent chloroplast movement in Lemna trisulca L. The Plant Journal. 20, 461-473 (1999).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Higa, T., Wada, M. Chloroplast avoidance movement is not functional in plants grown under strong sunlight. Plant, Cell and Environment. 39, 871-882 (2016).
- . Arduino.cc Available from: https://www.arduino.cc (2021)
- Königer, M., Delamaide, J. A., Marlow, E. D., Harris, G. C. thaliana leaves with altered chloroplast numbers and chloroplast movement exhibit impaired adjustments to both low and high light. Journal of Experimental Botany. 59, 2285-2297 (2008).
