מדידת מתחמי העברת אלקטרונים מיטוכונדריאליים ברקמת לב קפואה בעבר מצאצאי החזירה: מודל להערכת שינויים ביו-אנרגטית מיטוכונדריאליים הנגרמים על ידי פעילות גופנית
Summary
הכנת דגימות מועשרות במיטוכונדריה מרקמות מוצקות שהוקפאו בעבר בארכיון אפשרה לחוקרים לבצע הערכות פונקציונליות ואנליטיות של המיטוכונדריה במודלים ניסיוניים שונים. מחקר זה מדגים כיצד להכין תכשירים מועשרים במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה ולבצע הערכות אנליטיות של המיטוכונדריה.
Abstract
פרופיל קומפלקס העברת האלקטרונים המיטוכונדריאלי (ETC) משתנה ברקמת הלב של הצאצא שנולד לזרועה מאומתנת. ההשערה שהוצעה ונבדקה הייתה שתרגיל אימהי קבוע של זריעה במהלך ההריון יגביר את היעילות המיטוכונדריאלית של ביו-אנרגטיקה של לב צאצאים. השערה זו נבדקה על ידי בידוד המיטוכונדריה באמצעות הליך בידוד מתון להערכת פרופילים מיטוכונדריאלי ETC וסופר-קומפלקס. ההליך המתואר כאן אפשר עיבוד של רקמות לב שהוקפאו בעבר בארכיון וביטל את הצורך בהכנת מיטוכונדריה טרייה להערכת מתחמי מיטוכונדריאלי ETC, מחשבי על ופרופילי פעילות מורכבים ETC. פרוטוקול זה מתאר את המדידה האופטימלית של קומפלקס חלבון ETC בחיסון מבוסס נוגדנים מרובי מולטיפלקסים והערכה סופר מורכבת באמצעות אלקטרופורזה ג’ל כחול-ילידי.
Introduction
מטרת פרוטוקול זה הייתה לספק צעדים מפורטים כדי להשיג הכנה מועשרת במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה בעבר עם טכנולוגיה חדשה של הפרעה מכנית באנרגיה נמוכה של רקמות המשפרת תמה רקמה ומיצוי של מיטוכונדריה. בשיטה זו, יעילות מיצוי משופרת מבלי ליצור מתח גיסת גבוה או טמפרטורה גבוהה וזמן הומוגניזציה קצר (10-12 s) הופכים בר השגה1.
כדי להשיג מיטוכונדריה מרקמה קפואה בארכיון הוא נכס בעל ערך לביצוע הן מחקרים פונקציונליים2 והן ביוכימיים3 אחרת לא ניתן לחזור בקלות בתנאי הניסוי המדויקים. נעשה שימוש בהומוגניזר זכוכית קדר-אלווהג’ם טפלון קלאסי או הומוגניזר דונסה ועדיין נמצא בשימוש במעבדות מחקר להומוגניזציה של רקמות רכות כגון כבד, כליות ומוח. עם זאת, הומוגניזציה של רקמות קשות כגון שריר ולב דורשת יותר זמן הומוגניזציה, טיפול באנזים, הומוגניזציה במהירות גבוהה וחוויית משתמש נרחבת. זה חסרון לחילוץ אברונים שלמים כגון מיטוכונדריה מרקמה קשה כגון שריר ולב. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה משמשת להשגת הכנה מועשרת במיטוכונדריה בתפוקה גבוהה לניתוח מתחמי חלבון של שרשרת הובלת אלקטרונים מיטוכונדריאליים (ETC) ויצירת מחשב העל שלהם ברקמות הלב שנקצרו צאצאים שנולדו לזרועה מאומתנת בישיבה, קפואה בחנקן נוזלי, ומאוחסנת ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. שיטה זו מאפשרת למשתמש לבודד את ההכנה המועשרת במיטוכונדריה מרקמות ארכיון שהוקפאו בעבר.
חשיפה ננו-חומרית חיצונית מכרסמים בהריון יכולה להשפיע לרעה על תפקוד הלב ועל הנשימה המיטוכונדריאלית ועל הביו-אנרגטיקה על צאצאים במהלך ההריון4. עם זאת, שינויים חיוביים הנגרמים על ידי פעילות אירובית ביו-אנרגטית מיוציטית עוברית במהלך ההריון טרם תועדו. עם זאת, מחקרים מתעוררים מספקים ראיות כי פעילות אירובית אימהית במהלך ההריון יש השפעה חיובית על תפקוד הלב העובר5. על מנת לספק ראיות נוספות, בוצע ניתוח ההשפעות האורך של פעילות גופנית אימהית על מתחמי שרשרת הנשימה המיטוכונדריאליים של הצאצאים (כלומר, קומפלקס I באמצעות Complex V) במהלך ההריון.
מחקר זה יש רלוונטיות בריאותית משמעותית מאז התוצאות עשויות להציע כי פעילות גופנית אימהית משפרת את היעילות של ייצור אנרגיה במיטוכונדריה הלבבית של הצאצאים. במחקר זה, חזירות (חזירה נקבה) שימשו כמודל לבעלי חיים משתי סיבות: (i) פיזיולוגיה לבבית דומה לאדם6, ו -(ii) קציר רקמת לב צאצאים מנקודות זמן שונות אפשרי תחת אישור IACUC מוסדי. המחקר המוצע נועד לענות על רבות מהשאלות הבסיסיות המקשרות בין פעילות אימהית לבין השפעותיה החיוביות הפוטנציאליות על ההרכב התאי והביוכימי של רקמת הלב של הצאצא. גישה זו דורשת טכניקות בידוד מיטוכונדריה עדינות אך יעילות מרקמת לב קפואה בעבר שהתקבלו ממחקרי אורך ארוכים ויקרים שהתייחסו לבעיות השינויים הביו-אנרגטיים בתוך מיוציטים לב עובריים במהלך ההריון. השיטה המתוארת במחקר זה מאפשרת ניצול סכומים גדולים של רקמה ארכיונית שהוקפאה בעבר להכנת מיטוכונדריה מועשרת הן במחקרים אנליטיים והן במחקרים פונקציונליים. המחקר גם יסייע למלא את פער הידע בתחום זה על ידי מתן נתונים ראשוניים, אשר יכול להוביל מחקרים עתידיים הקובעים את ההשפעות של פעילות גופנית אימהית על בריאות הלב ברחם ומעבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים עבור פרוטוקול זה מצוינים כאן. ראשית, הומוגניזציה רקמות צריך להיות מטופל בקפידה, כך השפעות מוחלטות לא ייושמו במהלך תהליך הומוגניזציה רקמות. יש להשתמש במגרסת רקמות, המהווה חלק מטכנולוגיית רכיבה על אופניים בלחץ (PCT) להומוגניזציה ראשונית של רקמות9. צעד זה יפחית את ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי המענק הפנים-ארצי של אוניברסיטת קנזס סיטי עבור עבדולבקי אגבאס ומלגת מחקר קיץ עבור דניאל בררה. המחברים אסירי תודה על עבודת העריכה של ד”ר יאן טאלי.
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
References
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116 (2020).
- Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73 (2019).
- Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
- May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095 (2020).
- Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
- Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
- Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
- Pressure Biosciences Inc. . Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , (2010).
- McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599 (2020).
- Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria–a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
- Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
