Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM
Summary
Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni a temperature fino a 70 °C, prima del congelamento a immersione per esperimenti crio-EM.
Abstract
Le griglie di campioni per esperimenti di crio-microscopia elettronica (crio-EM) sono solitamente preparate ad una temperatura ottimale per la conservazione di campioni biologici, per lo più a 4 °C e occasionalmente a temperatura ambiente. Recentemente, abbiamo scoperto che la struttura proteica risolta a bassa temperatura potrebbe non essere funzionalmente rilevante, in particolare per le proteine degli archei termofili. È stata sviluppata una procedura per preparare campioni proteici a temperature più elevate (fino a 70 °C) per l’analisi crio-EM. Abbiamo dimostrato che le strutture provenienti da campioni preparati a temperature più elevate sono funzionalmente rilevanti e dipendenti dalla temperatura. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni ad alta temperatura, usando 55 °C come esempio. L’esperimento si è avvalso di un apparecchio di vetrificazione modificato mediante una provetta da centrifuga supplementare e i campioni sono stati incubati a 55 °C. Le procedure dettagliate sono state messe a punto per ridurre al minimo la condensa del vapore e ottenere un sottile strato di ghiaccio sulla griglia. Vengono forniti esempi di esperimenti riusciti e falliti.
Introduction
La tecnologia crio-EM per risolvere le strutture dei complessi proteici ha continuato a migliorare, in particolare nella direzione di ottenere strutture ad alta risoluzione 1,2. Nel frattempo, anche il panorama della sua applicazione è stato ampliato variando le condizioni del campione come pH o leganti prima del processo di vetrificazione3, che prevede la preparazione di griglie di campionamento seguite dal congelamento a tuffo 4,5. Un’altra condizione importante è la temperatura. Sebbene gli esperimenti crio-EM, come la cristallografia a raggi X, vengano eseguiti a basse temperature, la struttura risolta dalla crio-EM riflette la struttura allo stato di soluzione prima della vetrificazione. Fino a poco tempo fa, la maggior parte degli studi crio-EM di analisi di singole particelle (SPA) utilizza campioni che vengono conservati sul ghiaccio (cioè a 4 °C) prima della vetrificazione6, sebbene un certo numero di studi utilizzi campioni a temperatura ambiente di circa 7,8,9,10 o fino a 42 °C 11. In un recente rapporto, abbiamo eseguito studi dipendenti dalla temperatura dell’enzima cheto-acido riduttoisomerasi (KARI) dall’archeone termofilo Sulfolobus solfataricus (Sso) a sei diverse temperature da 4 ° C a 70 ° C12. I nostri studi suggeriscono che è importante preparare griglie di campioni a temperature funzionalmente rilevanti e che la crio-EM è l’unico metodo strutturale praticamente fattibile per risolvere la struttura dello stesso complesso proteico a più temperature.
La principale difficoltà per la vetrificazione ad alte temperature è ridurre al minimo la condensa del vapore e ottenere ghiaccio sottile. Qui riportiamo il protocollo dettagliato utilizzato per la preparazione di griglie campione ad alte temperature nel nostro precedente studio di Sso-KARI 12. Partiamo dal presupposto che i lettori o gli spettatori abbiano già esperienza nella preparazione complessiva del campione e nelle procedure di elaborazione dei dati per gli esperimenti crio-EM e sottolineiamo gli aspetti rilevanti per l’alta temperatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nella fase 1 del protocollo, assicurarsi che il tubo della centrifuga sia stato installato bene e non cada quando l’esperimento è in corso. A causa dell’accumulo di un gran numero di goccioline d’acqua nella camera, che potrebbero modificare la capacità di adsorbimento della carta da filtro, si raccomanda che il tempo complessivo dell’esperimento non superi i 30 minuti dopo che la camera dell’apparato di vetrificazione ha raggiunto la temperatura di equilibrio. Se il tempo di funzionamento supera i 30 minuti, l’operato…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Hervé Remigy di Thermo Fisher Scientific per gli utili consigli. Gli esperimenti crio-EM sono stati eseguiti presso l’Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM è sostenuto da Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) e Taiwan Protein Project (sovvenzione n. AS-KPQ-109-TPP2). Gli autori ringraziano anche la signora Hui-Ju Huang per l’assistenza nella preparazione del campione.
Materials
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do’s and don’ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
