Измерения резонансного переноса энергии Фёрстера в живых растительных клетках
Summary
Предусмотрен протокол для установки стандартного конфокального лазерного сканирующего микроскопа для измерений резонансной передачи энергии in vivo Förster с последующей оценкой данных.
Abstract
Эксперименты с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET) на основе сенсибилизированного излучения легко выполняются, но зависят от микроскопической установки. Конфокальные лазерные сканирующие микроскопы стали рабочей лошадкой для биологов. Коммерческие системы обеспечивают высокую гибкость в регулировке мощности лазера и чувствительности детектора и часто объединяют различные детекторы для получения идеального изображения. Однако сравнение данных, основанных на интенсивности, из разных экспериментов и установок часто невозможно из-за этой гибкости. Удобные для биологов процедуры являются преимуществом и позволяют легко и надежно настраивать настройки лазера и детектора.
Кроме того, поскольку эксперименты FRET в живых клетках зависят от изменчивости экспрессии белка и соотношения донор-акцептор, для оценки данных необходимо учитывать уровни экспрессии белка. Здесь описан простой протокол для надежных и воспроизводимых измерений FRET, включая процедуры оценки экспрессии белка и регулировки интенсивности лазера и настроек детектора. Оценка данных будет проводиться путем калибровки с флуорофорным слиянием известной эффективности FRET. Для повышения простоты сравнивались поправочные коэффициенты, полученные в клетках и путем измерения рекомбинантных флуоресцентных белков.
Introduction
Резонансный перенос энергии Фёрстера ((F)RET) обычно наблюдается с помощью флуоресцентной спектроскопии, хотя сам процесс не ограничивается происходящим между флуорофорами. Лежащая в основе диполь-дипольная связь просто требует светоизлучающей донорской молекулы и светопоглощающего акцептора. Это получено из требуемого спектрального перекрытия интеграла J нормализованных спектров излучения донора и акцепторного поглощения1. Однако, поскольку RET конкурирует с флуоресценцией, передача энергии становится измеримой за счет изменений в флуоресцентном излучении: RET вызывает закалку донора и сенсибилизированную акцепторную эмиссию.
RET на основе флуорофора был назван флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET), чтобы отделить его от биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET). RET сильно зависит от расстояния между донором и акцептором, которое широко находится в диапазоне 0,5-10 нм2 и, таким образом, в том же диапазоне, что и размеры белков и их комплексов. Во-вторых, RET зависит от дипольно-дипольной ориентации каппа в квадрате. В сочетании с тем, что вращательной свободой связанных с белком флуорофоров можно пренебречь из-за молекулярной массы и медленной вращательной релаксации, RET позволяет анализировать конформационные изменения3.
Так называемый радиус Фёрстера основан на спектральном интеграле перекрытия и диапазоне длин волн перекрытия, так что красные хромофоры, поглощающие свет, приводят к более длинным радиусам Фёрстера, чем поглощающие синий свет красители. Поскольку динамический диапазон измерений FRET ограничен 0,5 × R0 и 1,5 × R0, пара FRET ECFP-EYFP имеет динамический диапазон 2,5-7,3 нм благодаря своему R0 4,9 нм4.
Яркость флуорофора задается произведением его коэффициента молярного вымирания и его квантового выхода. Для измерений FRET выгодно выбирать флуорофоры почти одинаковой яркости. Это улучшает обнаружение закалки доноров и сенсибилизированного акцепторного излучения. Это также способствует калибровке системы микроскопии. Глядя на часто используемые пары FRET синих и флуоресцентных белков, становится очевидной более низкая яркость синих флуоресцентных белков (рисунок 1A).
Однако срок службы акцептора должен быть ниже срока службы донора, обеспечивая доступность акцептора для передачи энергии. Если срок службы акцептора превышает срок службы донора, акцептор все еще может находиться в возбужденном состоянии, когда донор снова возбуждается. Усовершенствованные голубые флуоресцентные белки, такие как mTurquoise, показывают увеличенное время жизни и, таким образом, способствуют увеличению вероятности FRET (рисунок 1B). Вероятность FRET также зависит от коэффициента молярного вымирания акцептора.
Protocol
Representative Results
Discussion
Закалка донором и сенсибилизированная акцепторная эмиссия характеризуются линейной зависимостью, которая позволяет проводить расчет FRET на основе донора или акцептора. Соответствующие факторы линейности называются либо G-фактором (донор к акцептору), либо xi (акцептор к донору), которы?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эксперименты проводились на технологической платформе световой микроскопии (LiMiTec) биологического факультета Билефельдского университета. Эта работа была профинансирована Билефельдским университетом.
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it’s done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
