살아있는 식물 세포에서 Förster 공명 에너지 전송 측정
Summary
생체 내 Förster 공명 에너지 전송 측정을 위한 표준 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 설정하고 데이터 평가를 위한 프로토콜이 제공됩니다.
Abstract
감미화 된 방출 기반 Förster 공명 에너지 전송 (FRET) 실험은 쉽게 수행되지만 미세한 설정에 의존합니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경은 생물학자를위한 주력이되었다. 상용 시스템은 레이저 전력 조정 및 검출기 감도에서 높은 유연성을 제공하며 종종 다른 검출기를 결합하여 완벽한 이미지를 얻을 수 있습니다. 그러나 이러한 유연성으로 인해 다양한 실험 및 설정에서 강도 기반 데이터를 비교하는 것은 종종 불가능합니다. 생물학자 친화적 인 절차는 장점이며 레이저 및 검출기 설정을 간단하고 신뢰할 수있는 조정할 수 있습니다.
더욱이, 살아있는 세포에 있는 FRET 실험은 단백질 발현 및 기증자 수용자 비율에 있는 가변성에 의해 영향을 받기 때문에, 단백질 발현 수준은 데이터 평가를 위해 고려되어야 합니다. 여기에 설명된 단백질 발현 및 레이저 강도 및 검출기 설정 조정을 위한 루틴을 포함하여 안정적이고 재현 가능한 FRET 측정을 위한 간단한 프로토콜이 있습니다. 데이터 평가는 알려진 FRET 효율의 불소 융합으로 교정에 의해 수행됩니다. 단순성을 향상시키기 위해, 교정 요인은 세포에서 그리고 재조합 형광 단백질을 측정해서 얻어진 비교되었습니다.
Introduction
Förster 공명 에너지 전송 (((F)RET)는 전형적으로 형광 분광법에 의해 관찰되지만, 공정 자체는 형광류 사이에서 발생하는 것으로 제한되지 않는다. 기본 이폴-이폴 커플링은 단순히 발광 기증자 분자와 빛을 흡수하는 수용자가 필요합니다. 이는 정규화된 기증자 방출 및 수용자 흡광도 스펙트럼의 필수 스펙트럼 중첩 일체형 J로부터 유래된다. 그러나 RET는 형광과 경쟁하기 때문에, 에너지 전달은 형광 방출의 변경에 의해 측정될 수 있게 됩니다: RET는 기증자의 담금질 및 감안기 방출을 유도합니다.
형광소 기반 RET는 생물 발광 공명 에너지 전달 (BRET)에서 분리하기 위해 형광 공명 에너지 전송 (FRET)이라고합니다. RET는 0.5-10 nm2 의 범위에서 널리 퍼져 있는 기증자와 수용자 사이의 거리에 크게 의존하며, 따라서 단백질과 그 복합체의 치수와 동일한 범위에서. 둘째, RET는 이폴-이폴 방향 카파 제곱에 의존한다. 단백질 에 바인딩된 형광의 회전적 자유가 분자량과 느린 회전 이완으로 인해 소홀히 할 수 있다는 사실과 결합된 RET는 형태 적 변화의 분석을 허용합니다3.
소위 Förster 반경은 스펙트럼 중첩 일체형과 겹침의 파장 범위를 기반으로하므로 적색 광 흡수 크로모포레스는 청광 흡수 염료보다 Förster radii가 더 길어집니다. FRET 측정의 동적 범위는 R0과 1.× 5 × R0으로 제한되기 때문에 FRET 쌍 ECFP-EYFP는 4.9 nm4의 R0으로 인해 2.5-7.3 nm의 동적 범위를 가지고 있습니다.
불소화의 밝기는 어금니 멸종 계수와 양자 수율의 제품에 의해 제공됩니다. FRET 측정의 경우 거의 유사한 밝기의 형광을 선택하는 것이 유리합니다. 이것은 기증자 담금질 및 감질된 수용자 방출의 탐지를 향상시킵니다. 또한 현미경 시스템의 교정을 선호합니다. 자주 사용되는 FRET 쌍의 시안 및 형광 단백질을 살펴보면 시안 형광 단백질의 낮은 밝기가 명백해집니다(그림 1A).
그러나 수용자의 수명은 기증자의 수명보다 낮아야 하며, 에너지 전달을 위한 수용자의 가용성을 보장해야 합니다. 수락자의 수명이 기증자의 수명을 초과하는 경우, 기증자가 다시 흥분할 때 수락자는 여전히 흥분 상태에있을 수 있습니다. mTurquoise와 같은 고급 시안 형광 단백질은 수명이 연장되어 FRET의 증가 확률에 기여합니다(그림1B). FRET의 확률은 또한 수용자의 어금니 소멸 계수에 따라 달라집니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기증자 담금질 및 민감 감응수용자 방출은 FRET의 기증자 또는 수용자 기반 계산을 허용하는 선형 관계가 특징입니다. 선형의 해당 요소는 상호 값4인 G 계수(기증자를 수락자)또는 xi(기증자에 대한 수락자)라고 합니다. 형광 현미경 검사법에 의한 형광 단백질 사이의 FRET를 측정하려면 형광 단백질의 광범위한 흡수 및 방출 스펙트럼으로 인해 DSBT 및 ASBT에 대한 교정이 종종 필요?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
실험은 생물학 학부의 빛 현미경 기술 플랫폼 (LiMiTec)에서 수행되었다, 빌레펠트 대학. 이 작품은 빌레펠트 대학에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it’s done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
