活植物细胞中的Förster共振能量转移测量
Summary
提供了一个方案，用于设置标准的共聚焦激光扫描显微镜，用于 体内 Förster共振能量转移测量，然后进行数据评估。
Abstract
基于敏化发射的Förster共振能量转移（FRET）实验很容易完成，但取决于微观设置。共聚焦激光扫描显微镜已成为生物学家的主力军。商用系统在激光功率调整和探测器灵敏度方面具有高度的灵活性，并且通常组合不同的探测器以获得完美的图像。然而，由于这种灵活性，通常不可能比较来自不同实验和设置的基于强度的数据。生物学家友好的程序具有优势，可以简单可靠地调整激光和探测器设置。
此外，由于活细胞中的FRET实验受到蛋白质表达和供体 – 受体比的变异性的影响，因此必须考虑蛋白质表达水平以进行数据评估。这里描述的是用于可靠和可重复的FRET测量的简单方案，包括用于估计蛋白质表达和调整激光强度和检测器设置的例程。数据评估将通过校准已知FRET效率的荧光团融合来执行。为了提高简单性，已经比较了在细胞中通过测量重组荧光蛋白获得的校正因子。
Introduction
Förster共振能量转移（（F）RET）通常通过荧光光谱观察，尽管该过程本身并不局限于荧光团之间发生。潜在的偶极子-偶极子耦合只需要一个发光的供体分子和一个光吸收受体。这是从归一化供体发射和受体吸光度谱1所需的光谱重叠积分J导出的。然而，由于RET与荧光竞争，能量转移可以通过荧光发射的改变来测量：RET诱导供体猝灭和敏化受体发射。
基于荧光团的RET被称为荧光共振能量转移（FRET），以将其与生物发光共振能量转移（BRET）分开。RET在很大程度上取决于供体和受体之间的距离，其范围广泛为0.5-10 nm2 ，因此与蛋白质及其复合物的尺寸范围相同。其次，RET取决于偶极子-偶极子取向kappa的平方。结合蛋白质结合的荧光团由于分子量和缓慢的旋转弛豫而可以忽略的事实，RET允许分析构象改变3。
所谓的Förster半径基于光谱重叠积分和重叠的波长范围，因此吸收红光的发色团比蓝光吸收染料产生更长的Förster半径。由于FRET测量的动态范围受到0.5×R0 和1.5×R0的限制，FRET对ECFP-EYFP的动态范围为2.5-7.3 nm，因为它的R0 为4.9 nm4。
荧光团的亮度由其摩尔消光系数和量子产率的乘积给出。对于FRET测量，选择亮度几乎相似的荧光团是有利的。这增强了对供体淬火和敏化受体发射的检测。它还有利于显微镜系统的校准。观察常用的FRET对青色和荧光蛋白，青色荧光蛋白的较低亮度变得明显（图1A）。
但是，受体的寿命必须低于供体的寿命，从而确保受体可用于能量转移。如果受体的寿命超过供体的寿命，则当供体再次激发时，受体可能仍处于激发状态。先进的青色荧光蛋白（如mTurquoise）显示出更长的使用寿命，因此有助于增加FRET的可能性（图1B）。FRET的概率还取决于受体的摩尔消光系数。
Protocol
Representative Results
Discussion
供体淬灭和敏化受体发射的特点是线性关系，允许基于供体或受体计算FRET。线性的相应因子称为 G 因子（供体对受体）或 xi（受体对供体），它们是倒数值4。由于荧光蛋白的广泛吸收和发射光谱，通过荧光显微镜测量荧光蛋白之间的FRET通常需要校正DSBT和ASBT。但是，许多校正依赖于可测量的 ASBT，这是协议第 7 节中方程分母的一个因素，α = 0 会导致未定义的方程5<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
实验在比勒费尔德大学生物学院的光学显微镜技术平台（LiMiTec）进行。这项工作由比勒费尔德大学资助。
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
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