Medidas de transferência de energia de ressonância förster em células vegetais vivas
Summary
Um protocolo é fornecido para a criação de um microscópio de varredura a laser confocal padrão para medições de transferência de energia de ressonância in vivo Förster, seguido de avaliação de dados.
Abstract
Os experimentos de transferência de energia de ressonância Förster (FRET) baseados em emissões sensibilizadas são facilmente feitos, mas dependem da configuração microscópica. Microscópios de varredura a laser confocal tornaram-se um cavalo de trabalho para biólogos. Os sistemas comerciais oferecem alta flexibilidade no ajuste de energia a laser e sensibilidade ao detector e muitas vezes combinam diferentes detectores para obter a imagem perfeita. No entanto, a comparação de dados baseados em intensidade de diferentes experimentos e configurações é muitas vezes impossível devido a essa flexibilidade. Procedimentos amigáveis ao biólogo são vantajosos e permitem um ajuste simples e confiável das configurações de laser e detector.
Além disso, como os experimentos de FRET em células vivas são afetados pela variabilidade na expressão proteica e nas razões de aceitação de doadores, os níveis de expressão proteica devem ser considerados para avaliação de dados. Descrito aqui é um protocolo simples para medições de FRET confiáveis e reprodutíveis, incluindo rotinas para a estimativa de expressão proteica e ajuste da intensidade do laser e configurações do detector. A avaliação dos dados será realizada por calibração com uma fusão fluoróvasa de eficiência fret conhecida. Para melhorar a simplicidade, foram comparados fatores de correção que foram obtidos nas células e medindo proteínas fluorescentes recombinantes.
Introduction
A transferência de energia de ressonância förster ((F)RET) é tipicamente observada pela espectroscopia de fluorescência, embora o processo em si não se limite a ocorrer entre fluoroforos. O acoplamento dipolo-dipolo subjacente simplesmente requer uma molécula de doador emissor de luz e um aceitador absorvedor de luz. Isso é derivado da sobreposição espectral necessária J integral da emissão de doadores normalizada e espectros de absorção de aceitação1. No entanto, como o RET compete com a fluorescência, a transferência de energia torna-se mensurável por alterações na emissão de fluorescência: RET induz a extinção de doadores e emissão de aceitadores sensibilizados.
O RET baseado em fluorophore foi chamado de fluorescência resonance energy transfer (FRET) para separá-lo da transferência de energia de ressonância bioluminescência (BRET). O RET depende fortemente da distância entre doador e aceitador, que está amplamente na faixa de 0,5-10 nm2 e, portanto, na mesma faixa das dimensões das proteínas e seus complexos. Em segundo lugar, o RET depende da orientação dipolo-dipolo kappa ao quadrado. Combinado com o fato de que a liberdade rotacional de fluoroforos ligados à proteína pode ser negligenciada devido ao peso molecular e ao relaxamento rotacional lento, o RET permite a análise de alterações conformais3.
O chamado raio Förster é baseado na sobreposição espectral integral e na faixa de comprimento de onda da sobreposição, de modo que os cromóforos absorventes de luz vermelha resultam em raios de Förster mais longos do que corantes absorventes de luz azul. Como a faixa dinâmica das medições fret é limitada por 0,5 × R0 e 1,5 × R0, o par FRET ECFP-EYFP tem um alcance dinâmico de 2,5-7,3 nm devido ao seu R0 de 4,9 nm4.
O brilho de um fluoróforo é dado pelo produto de seu coeficiente de extinção molar e seu rendimento quântico. Para as medidas do FRET, é vantajoso escolher fluoroforos de brilho quase semelhante. Isso aumenta a detecção de emissão de doadores saciados e sensibilizados. Também favorece a calibração do sistema de microscopia. Olhando para os pares de proteínas cianos e fluorescentes frequentemente usados, o menor brilho das proteínas fluorescentes de ciano torna-se óbvio (Figura 1A).
No entanto, a vida útil do aceitor deve ser menor do que a vida útil do doador, garantindo a disponibilidade do aceitador para transferência de energia. Se a vida útil do aceitor exceder a vida útil do doador, o aceitador ainda pode estar no estado animado quando o doador estiver animado novamente. Proteínas fluorescentes de ciano avançado, como a mTurquoise, mostram uma vida útil prolongada e, portanto, contribuem para uma maior probabilidade de FRET (Figure1B). A probabilidade de FRET também depende do coeficiente de extinção molar do aceitador.
Protocol
Representative Results
Discussion
A emissão de aceitadores de doadores e sensibilizadas são caracterizadas por uma relação linear que permite o cálculo baseado em doadores ou aceitadores de FRET. Os fatores correspondentes de linearidade são chamados fator G (doador para aceitador) ou xi (aceitador ao doador), que são valores recíprocos4. Medir o FRET entre proteínas fluorescentes por microscopia de fluorescência muitas vezes requer correções para DSBT e ASBT devido ao amplo espectro de absorção e emissão das prote?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os experimentos foram realizados na Plataforma de Tecnologia de Microscopia Leve (LiMiTec) da Faculdade de Biologia da Universidade bielefeld. Este trabalho foi financiado pela Universidade Bielefeld.
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
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