Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Short Hairpin RNA-Mediado Gene Knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro
Summary
Aqui fornecemos um protocolo para triagem de potenciais fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento de células dendríticas (DC) usando transdução lentiviral de shRNA para obter linhas celulares de knockdown estáveis para diferenciação in vitro DC.
Abstract
As células dendríticas (DCs) são células importantes que apresentam antígenos que conectam respostas imunes inatas e adaptáveis. Os DCs são heterogêneos e podem ser divididos em DCs convencionais (cDCs) e DCs plasmacitóides (pDCs). cDCs é especializado em apresentar antígenos e ativar células T ingênuas. Por outro lado, os pDCs podem produzir grandes quantidades de interferons tipo I (IFN-I) durante a infecção viral. A especificação dos DCs ocorre em um estágio inicial de progenitores de DC na medula óssea (MM) e é definida por uma rede de fatores de transcrição (TFs). Por exemplo, cDCs altamente expressam ID2, enquanto pDCs altamente expressos E2-2. Uma vez que cada vez mais subconjuntos de DCs estão sendo identificados, há um crescente interesse em entender TFs específicos controlando o desenvolvimento de DC. Aqui, estabelecemos um método para tela de TFs críticos para a diferenciação de DCs in vitro , fornecendo lentivírus carregando RNA de grampo de cabelo curto (shRNA) em uma linha de células hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas (iHSPCs). Após a seleção e diferenciação in vitro , o potencial de CDC e pDC das linhas celulares de knockdown estáveis são analisados por citometria de fluxo. Essa abordagem fornece uma plataforma para identificar genes potencialmente regendo os destinos dc de progenitores in vitro.
Introduction
Os DCs são os principais reguladores da imunidade inata e adaptativa1. Os DCs são classificados principalmente em duas populações funcionalmente distintas, ou seja, pDCs e cDCs. Além disso, os cDCs compreendem dois subconjuntos, ou seja, cDCs tipo I e tipo II ou cDC1s e cDC2s, respectivamente2. pDCs, expressando BST2, Siglec-H, e níveis intermediários de CD11c em camundongos3,4, são as células que podem segregar grandes quantidades de IFN-I durante inflamação e infecção viral5. Devido à sua robusta capacidade de produção ifn-I, eles também são suspeitos de desempenhar um papel fundamental na progressão de doenças autoimunes, incluindo lúpus eritematoso sistêmico (SLE)6. cDC1s, definidos pela expressão superficial de XCR1, CD8a, CLEC9A e CD103 em camundongos7, são especializados na ativação e polarização de células CD8+ (CTLs) citotóxicas através da apresentação cruzada de antígenos, iniciando assim a imunidade tipo I em resposta a patógenos intracelulares e câncer8,9. Por outro lado, cDC2s, expressando CD11b e CD172α (também conhecido como Sirpα) em humanos e camundongos, podem ativar células T CD4+ e promover a resposta imune tipo II contra alérgenos e parasitas10, bem como modular a imunidade tipo III após o reconhecimento extracelular de bactérias e microbiota11,12.
A diversificação de DCs é determinada por um grupo de TFs de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) no BM. E2-2 (codificado por Tcf4) é um regulador mestre para diferenciação e função dos pDCs13,14. Em contraste, o inibidor da ligação de DNA 2 (ID2) impulsiona a especificação do CDC e inibe o desenvolvimento do PDC através do bloqueio da atividade proteica E15. Além disso, o desenvolvimento de cDC1s requer IRF8 e BATF3, enquanto a diferenciação de cDC2s depende muito do IRF416. Trabalhos recentes têm explorado a heterogeneidade dos pDCs17 e cDCs e sua regulamentação transcricional18. Devido à complexidade da rede DC, há uma necessidade não atendida de estabelecer uma plataforma para identificar outros TFs que controlam o desenvolvimento e funcionalidade dos DCs.
Aqui, utilizamos um iHSPC que foi gerado expressando translocação nuclear regulamentada por estrogênio de Hoxb8 em células BM (também conhecidas como células Hoxb8-FL)19. os iHSPCs podem proliferar e permanecer em um estágio indiferenciado na presença de ligantes β-estradiol e Flt3 (FL), enquanto eles começam a se diferenciar em diferentes tipos de DC na presença de FL após a retirada de β-estradiol19. Com base nesse recurso, podemos derrubar genes de interesse no estágio progenitor, seguido por examinar o efeito sobre a diferenciação in vitro de pDCs e cDCs. Portanto, este método é uma ferramenta poderosa para descobrir os genes que regulam o desenvolvimento e a função dos DCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vetores de shRNA baseados em lentivírus são frequentemente usados para silenciamento genético por transdução viral em células e permitem integração estável no genoma hospedeiro. No entanto, várias eficiências de transdução em diferentes tipos de células precisam ser consideradas, e uma série de abordagens foram tomadas para superar esse problema.
Polybrene é um polímero policalítico que pode neutralizar as cargas na membrana celular, aumentando assim a ligação da virion à…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o apoio técnico do Dr. Tz-Ling Chen. Agradecemos ao National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) por fornecer shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 e MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Materials
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
References
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