ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması
Summary
Omurilik insan kaynaklı pluripotent kaynaklı astrositleri ve nöronları ve elektrofizyolojik kayıt için ortak kültürlerini ayırt etmek için bir yöntem tanımladık.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı astrositler (hiPSC-A) ve nöronlar (hiPSC-N), Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) patofizyolojisini in vitro olarak modellemek için güçlü bir araç sağlar. Çok elektrot dizisi (MEA) kayıtları, büyük nöron popülasyonlarından elektrik alan potansiyellerini kaydetmenin ve zaman içindeki ağ aktivitesini analiz etmenin bir yoludur. Daha önce, omurilik astrosit fenotipini teşvik etmek için teknikler kullanılarak farklılaştırılan hiPSC-A’nın varlığının, hiPSC-A olmadan veya kemirgen astrositlerinin varlığında kültürlenenlere kıyasla, bölgesel olarak spesifik omurilik hiPSC-motor nöronlarının (MN) olgunlaşmasını ve elektrofizyolojik aktivitesini geliştirdiği gösterilmiştir. Burada açıklanan, omurilik hiPSC-A’yı hiPSC-MN ile birlikte kültürlemek ve MEA kayıtlarını kullanarak elektrofizyolojik aktiviteyi kaydetmek için bir yöntemdir. Burada açıklanan farklılaşma protokolleri, omuriliğe bölgesel olarak özgü astrositlere ve nöronlara özgü olsa da, ortak kültürleme platformu, kortikal hiPSC-A ve hiPSC-N dahil olmak üzere diğer kaderlere özgü tekniklerle farklılaştırılmış astrositlere ve nöronlara uygulanabilir. Bu protokoller, glia-nöron etkileşimleri hakkında bilgi vermek için elektrofizyolojik bir test sağlamayı ve ALS’de terapötik potansiyeli olan ilaçları test etmek için bir platform sağlamayı amaçlamaktadır.
Introduction
İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı astrositler (hiPSC-A) ve nöronlar (hiPSC-N), Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) patofizyolojisini in vitro olarak modellemek için güçlü araçlardır ve ilaç keşif stratejileri için translasyonel bir paradigma sağlar1. Araştırmacılar, hiPSC-A’nın hiPSC-N ile ortak kültürünün, her iki hücre tipinin morfolojik, moleküler, elektrofizyolojik ve farmakolojik olgunlaşmasını arttırdığını, karmaşık nöronal ağlar ve in vivo muadillerine benzeyen astrosit-nöron etkileşimleri ürettiğini göstermiştir 2,3. Benzer ko-kültür deneyleri, astrosit aracılı nörotoksisite 4,5 ve nöronal hiper-uyarılabilirlik6 gibi ALS patobiyolojisinin ayırt edici özelliklerini özetleyebilir. Ek olarak, farklılaşma protokollerindeki ilerlemelerle, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC), kortikal ve omurilik hiPSC-A ve hiPSC-N 7,8 dahil olmak üzere bölgesel olarak spesifik nöral alt tiplere ayrılabilir. Bu stratejiler, ALS’de kortikal ve spinal motor nöron patolojisinin modellenmesi için potansiyel ve her ikisi üzerindeki astrositik etkiyi sağlar. Bununla birlikte, bu, bu etkileri belirlemek için tekrarlanabilir bir fonksiyonel tahlil yapılmasını gerektirir.
Son zamanlarda, çoklu elektrot dizisi (MEA) kaydının nöron-astrosit ortak kültürlerinin elektrofizyolojik karakterizasyonu için özellikle uygun olduğu gösterilmiştir2. Tek hücreli elektrofizyolojik analizlerin aksine, bu yüksek yoğunluklu elektrot dizileri, kültür koşullarını bozmadan ve hücre zarlarının bütünlüğünü korumadan büyük nöron popülasyonlarından hücre dışı alan potansiyellerini pasif olarak kaydeder. Bu platformlar, kültürlerin hücresel ve ağ aktivitesini zaman içinde ve farmakolojik manipülasyona yanıt olarak kaydetmek için özellikle yararlıdır. Son olarak, astrositlerin varlığı bir kültür değişkeni olduğunda, MEA kayıtları astrosit-nöron çift yönlü etkileşimleri hakkında işlevsel bilgiler sağlayabilir 2,9.
Burada, hiPSC’nin omurilik hiPSC-A ve daha önce doğrulanmış olan hiPSC-motor nöronlara (MN) farklılaşması için optimize edilmiş bir protokolsunulmaktadır 2. Omurilik hiPSC-A farklılaşma protokolü tutarlı bir şekilde, hücrelerin sırasıyla% 80,% 50 ve% 90’ına kadar S100 kalsiyum bağlayıcı protein B (S100β), glial fibriler asidik protein (GFAP) ve Homeobox B4 (HOXB4) için pozitif olan astrosit kültürleriyle sonuçlanır ve olgunlaşan bir glial ve omurilik spesifikasyonunu gösterir 2,10 . HiPSC-MN farklılaşma protokolü, olgun bir alfa-motor nöron kimliği2’yi düşündüren kolin asetiltransferaz (ChAT) için% >90 pozitif nöronlar üretir. Ek olarak, protokol, astrositsiz veya kemirgen astrositleri olan nöronal kültürlerle karşılaştırıldığında, Scholl analizi ve immünofloresan mikroskopi ile artmış morfolojik karmaşıklığa sahip nöronlarla sonuçlandığı daha önce gösterilen hiPSC-A / MN ortak kültürlerinin üretilmesi için teknikleri açıklamaktadır2. Bu tanımlar omurilik hiPSC-A ve hiPSC-N’ye özgü olsa da, benzersiz bir avantaj, astrositlerin ve nöronların başlangıçtaki bağımsız kültürünün, daha sonraki zaman noktalarında ko-kültüre yönelik adımların ardından, diğer spesifik bölgelerden ve hastalığa özgü hücrelerden nöron-astrosit etkileşimlerinin etkilerini incelemek içinçevrilebilmesidir7,8 . Son olarak, protokol bu kültürlerin MEA plakalarında nasıl yetiştirileceğini açıklar, böylece ko-kültür kompozisyonunun bir faktörü olarak fonksiyonel aktivite, hücresel kompozisyonu ve kültür koşullarını manipüle etme yeteneği ile zaman içinde incelenebilir.
Bu protokollerin amacı, astrosit-nöron etkileşimlerini araştırmak, hastalığa özgü değişiklikleri incelemek ve ALS alanında terapötik potansiyele sahip ilaçları test etmek için fonksiyonel bir test sağlamaktır. Bu protokolün en zorlu adımları için video talimatları sağlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bugüne kadar, astrosit-nöron ortak kültürlerinin elektrofizyolojik kayıtları için hiPSC ve MEA tabanlı yöntemler, epilepsi9’un in vitro modellemesi için daha yaygın kullanımlarının aksine, ALS6 alanında sınırlı bir uygulama alanı bulmuş ve hala tam olarak insan platformlarında bulunmamıştır. Bununla birlikte, bu platform, nöronal hipereksitabilite mekanizmaları, astrositin nörotoksisiteye katkısı veya ağ aktivitesinin hastalığın ile…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu makale aşağıdaki makaleler tarafından desteklenmiştir: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Hayırsever Vakfı Klinik Bilim İnsanı Kariyer Geliştirme Ödülü (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Açıklanan elektrofizyolojik platformu doğrulamak için kullandığımız MEA platformunu ve veri analiz yazılımını sağladıkları için Dr. Raha Dastgheyb ve Dr. Norman Haughey’e teşekkür ederiz. Khalil Rust’a protokol gösterimi ve çekimleri konusundaki yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
References
- Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
- Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
- Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
- Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
- Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
- Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
- Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
- Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
- Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
- Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
- Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
- Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
- Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).
