إنشاء منصة فيزيولوجية كهربية لنمذجة ALS مع الخلايا النجمية والخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات الخاصة بالمنطقة
Summary
وصفنا طريقة للتمييز بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية المشتقة من الحبل الشوكي التي يسببها الإنسان وثقافتها المشتركة للتسجيل الكهربيفيزيولوجي.
Abstract
توفر الخلايا النجمية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-A) والخلايا العصبية (hiPSC-N) أداة قوية لنمذجة الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري (ALS) في المختبر. تعد تسجيلات الصفيف متعدد الأقطاب الكهربائية (MEA) وسيلة لتسجيل إمكانات المجال الكهربائي من مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية وتحليل نشاط الشبكة بمرور الوقت. وقد ثبت سابقا أن وجود hiPSC-A المتمايز باستخدام تقنيات لتعزيز النمط الظاهري للخلايا النجمية للحبل الشوكي يحسن النضج والنشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية الحركية للحبل الشوكي (MN) عند مقارنتها بتلك المستزرعة بدون hiPSC-A أو في وجود الخلايا النجمية للقوارض. الموصوفة هنا هي طريقة لمشاركة زراعة الحبل الشوكي hiPSC-A مع hiPSC-MN وتسجيل النشاط الكهربي باستخدام تسجيلات MEA. في حين أن بروتوكولات التمايز الموصوفة هنا خاصة بالخلايا النجمية والخلايا العصبية الخاصة إقليميا بالحبل الشوكي ، يمكن تطبيق منصة الاستزراع المشترك على الخلايا النجمية والخلايا العصبية المتباينة بتقنيات خاصة بمصائر أخرى ، بما في ذلك hiPSC-A القشري و hiPSC-N. تهدف هذه البروتوكولات إلى توفير مقايسة فيزيولوجية كهربية للإبلاغ عن تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية وتوفير منصة لاختبار الأدوية ذات الإمكانات العلاجية في ALS.
Introduction
الخلايا النجمية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-A) والخلايا العصبية (hiPSC-N) هي أدوات قوية لنمذجة الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري (ALS) في المختبر وتوفر نموذجا متعديا لاستراتيجيات اكتشاف الأدوية1. لقد أثبت الباحثون أن الثقافة المشتركة ل hiPSC-A مع hiPSC-N تعزز النضج المورفولوجي والجزيئي والفيزيولوجي الكهربي والدوائي لكلا النوعين من الخلايا ، مما يولد شبكات عصبية معقدة وتفاعلات الخلايا العصبية النجمية التي تشبه نظيراتها في الجسم الحي 2,3. يمكن لتجارب الاستزراع المشترك المماثلة أن تلخص السمات المميزة لعلم الأحياء المرضي ALS مثل السمية العصبية بوساطة الخلايا النجمية 4,5 وفرط استثارة الخلايا العصبية6. بالإضافة إلى ذلك ، مع التقدم في بروتوكولات التمايز ، يمكن تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSC) إلى أنواع فرعية عصبية خاصة بالمنطقة ، بما في ذلك hiPSC-A و hiPSC-N 7,8 القشرية والحبل الشوكي. توفر هذه الاستراتيجيات إمكانية نمذجة أمراض الخلايا العصبية الحركية القشرية والشوكية في ALS بالإضافة إلى التأثير النجمي على كليهما. ومع ذلك ، يتطلب هذا وجود اختبار وظيفي قابل للتكرار لتحديد هذه الآثار.
لقد تبين مؤخرا أن تسجيل صفيف متعدد الأقطاب الكهربائية (MEA) مناسب بشكل خاص للتوصيف الفيزيولوجي الكهربي للثقافات المشتركة بين الخلايا العصبية والنجمية2. على عكس التحليلات الفيزيولوجية الكهربية أحادية الخلية ، تسجل هذه المصفوفات الكهربية عالية الكثافة بشكل سلبي إمكانات المجال خارج الخلية من مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية دون تعطيل ظروف الثقافة والحفاظ على سلامة أغشية الخلايا. هذه المنصات مفيدة بشكل خاص لتسجيل النشاط الخلوي والشبكي للثقافات بمرور الوقت واستجابة للتلاعب الدوائي. أخيرا ، عندما يكون وجود الخلايا النجمية متغيرا ثقافيا ، يمكن أن توفر تسجيلات MEA رؤى وظيفية حول التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية 2,9.
يظهر هنا بروتوكول محسن لتمايز hiPSC إلى hiPSC-A الحبل الشوكي والخلايا العصبية الحركية hiPSC (MN) التي تم التحقق من صحتها مسبقا2. ينتج عن بروتوكول تمايز الحبل الشوكي hiPSC-A باستمرار مزارع الخلايا النجمية ، والتي تكون إيجابية لبروتين S100 المرتبط بالكالسيوم B (S100β) ، والبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، و Homeobox B4 (HOXB4) في ما يصل إلى 80٪ و 50٪ و 90٪ من الخلايا ، على التوالي ، مما يشير إلى نضج مواصفات الحبل الدبقي والشوكي 2,10 . يولد بروتوكول التمايز hiPSC-MN خلايا عصبية إيجابية بنسبة >90٪ ل الكولين أسيتيل ترانسفيراز (ChAT) ، مما يوحي بهوية الخلايا العصبية الحركية ألفاالناضجة 2. بالإضافة إلى ذلك ، يصف البروتوكول تقنيات لتوليد الثقافات المشتركة hiPSC-A / MN التي ثبت سابقا أنها تؤدي إلى خلايا عصبية ذات تعقيد مورفولوجي معزز من خلال تحليل شول والفحص المجهري المناعي عند مقارنتها بالثقافات العصبية بدون الخلايا النجمية أو مع الخلايا النجمية للقوارض2. في حين أن هذه الأوصاف خاصة ب hiPSC-A و hiPSC-N للحبل الشوكي ، فإن الميزة الفريدة هي أن الثقافة المستقلة الأولية للخلايا النجمية والخلايا العصبية متبوعة بخطوات للثقافة المشتركة في نقاط زمنية لاحقة يمكن ترجمتها لدراسة آثار تفاعلات الخلايا العصبية والنجمية من مناطق محددة أخرى بالإضافة إلى الخلايا الخاصة بالمرض 7,8 . وأخيرا، يصف البروتوكول كيفية زراعة هذه الثقافات على لوحات MEA بحيث يمكن دراسة النشاط الوظيفي كعامل لتكوين الاستزراع المشترك بمرور الوقت مع القدرة على معالجة التكوين الخلوي وكذلك ظروف الثقافة.
الهدف من هذه البروتوكولات هو توفير اختبار وظيفي للتحقيق في تفاعلات الخلايا العصبية النجمية ، وفحص التغيرات الخاصة بالمرض ، واختبار الأدوية ذات الإمكانات العلاجية في مجال ALS. يتم توفير تعليمات الفيديو للخطوات الأكثر تحديا في هذا البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
حتى الآن ، وجدت الطرق القائمة على hiPSC و MEA للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية للمزارع المشتركة بين الخلايا العصبية النجمية تطبيقا محدودا في مجال ALS6 ولا تزال غير موجودة في المنصات البشرية بالكامل ، على عكس استخدامها الأكثر انتشارا للنمذجة المختبرية للصرع9. ومع ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه المخطوطة بما يلي: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH / NINDS (CWH) ، 2020 جائزة التطوير الوظيفي للعلماء السريريين لمؤسسة دوريس ديوك الخيرية (CWH). 1R01NS117604-01NIH / NINDS (NJM) ، DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM) ، 2019 MSCRFD 5122 (NJM). نشكر الدكتورة رها دستغيب والدكتور نورمان هوغي على توفير منصة MEA وبرامج تحليل البيانات التي استخدمناها للتحقق من صحة منصة الفيزيولوجيا الكهربية الموصوفة. نود أن نشكر خليل روست على مساعدتهم في عرض البروتوكول والتصوير.
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
References
- Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
- Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
- Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
- Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
- Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
- Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
- Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
- Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
- Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
- Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
- Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
- Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
- Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).
