ניסויי NMR בלחץ גבוה לאיתור מצבים קונפורמציה נמוכים של חלבון
Summary
אנו מספקים תיאור מפורט של השלבים הנדרשים כדי להרכיב תא בלחץ גבוה, להגדיר ולתעד ניסויי NMR בלחץ גבוה, ולבסוף לנתח הן את עוצמת השיא והן שינויים במשמרות כימיות תחת לחץ. ניסויים אלה יכולים לספק תובנות חשובות על המסלולים המתקפלים והיציבות המבנית של חלבונים.
Abstract
לחץ גבוה הוא שיטת סוטה ידועה שניתן להשתמש בה כדי לערער חלבונים כדוריים ולנתק מתחמי חלבון באופן הפיך. לחץ הידרוסטטי מניע שיווי משקל תרמודינמי לכיוון המדינה(ים) עם נפח הטוחנת התחתונה. לחץ גובר מציע, אם כן, את ההזדמנויות לכוונן היטב את היציבות של חלבונים כדוריים ואת שיווי המשקל אוליגומריזציה של מתחמי חלבון. ניסויי NMR בלחץ גבוה מאפשרים אפיון מפורט של הגורמים המסדירים את היציבות של חלבונים כדוריים, מנגנוני הקיפול שלהם ומנגנוני האוליגומריזציה על ידי שילוב יכולת כוונון היציבות העדינה של סטיית לחץ ורזולוציית האתר המוצעת על ידי ספקטרוסקופיית NMR פתרון. כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לחקור את היציבות המתקפלת המקומית של חלבון באמצעות קבוצה של ניסויי 2D 1H-15N שנרשמו מ 1 בר ל 2.5 kbar. השלבים הנדרשים לרכישה וניתוח של ניסויים כאלה מודגמים בנתונים שנרכשו בתחום RRM2 של hnRNPA1.
Introduction
זה זמן רב מוכר כי אנרגיה גבוהה יותר, מאוכלס בדלילות מצבים קונפורמציה של חלבונים ומתחמי חלבון לשחק תפקיד מפתח במסלולים ביולוגיים רבים1,2,3. הודות לניסויים המבוססים על קאר-פרסל-מייבום-גיל (CPMG)4, העברת רוויית חילופי כימיקלים (CEST)5,והעברת רוויית חילופי מצב כהה (DEST)6 רצפי פעימה (בין היתר), ספקטרוסקופיית NMR פתרון התגלתה כשיטת בחירה לאפיון מצבי קונפורמציה ארעיים7. יחד עם ניסויים אלה, perturbations כגון טמפרטורה, pH, או denaturants כימי ניתן להציג כדי להגדיל את האוכלוסייה היחסית של תת-מצבים קונפורמציה אנרגיה גבוהה יותר. באופן דומה, חלבון שיווי משקל יכול גם להיות מוטרד על ידי הפעלת לחץ הידרוסטטי גבוה. בהתאם לעוצמת השינוי בנפח הקשור לשינויים הקונפורמציה המתאימים, עלייה בלחץ בכמה מאות עד כמה אלפי ברים יכולה לייצב באופן משמעותי מצבאנרגיהגבוה יותר או לגרום לחלבון להתפתח לחלוטין 8,9,10. ספקטרום NMR חלבון מציג בדרך כלל שני סוגים של שינויים עם לחץ הידרוסטטי: (i) שינויים בשינויים כימיים ו-(ii) שינויים בעוצמת השיא. שינויים בהזזה כימית משקפים שינויים בממשק מי פני השטח של החלבון ו/או דחיסה מקומית של מבנה החלבון בסולם זמן מהיר (יחסית לסולם הזמן של NMR)11. הצלבות המציגות משמרות כימיות גדולות שאינן ליניאריות תלות בלחץ יכולות להצביע על נוכחות של מצבים קונפורמציה באנרגיה גבוהה יותר12,13. מצד שני, שינויי עוצמת שיא מצביעים על מעברים קונפורמיים משמעותיים בסולם זמן איטי, כגון שינויים באוכלוסיות המצב המקופלות/נפרשות. נוכחות של ביניים מתקפלים או מצבי אנרגיה גבוהים יותר ניתן לזהות מ וריאציות גדולות בסדר הגודל של שינוי נפח על התגלגלות נמדד עבור שאריות שונות של חלבון נתון14,15,16,17. בהתבסס על הניסיון שלנו, אפילו חלבונים קטנים המסווגים בדרך כלל כתיקיות של שתי מדינות מציגים תגובות לא אחידות ללחץ, המספק מידע שימושי על היציבות המתקפלת המקומית שלהם. מתואר כאן פרוטוקול לרכישה וניתוח של עוצמת שיא amide 1H כימי מעביר תלות בלחץ, באמצעות חלבון מודל מוטיב זיהוי RNA מבודד 2 (RRM2) של ribonucleoprotein גרעיני הטרוגניים A1 (hnRNPA1).
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מפרט פרוטוקול המיושם לבדיקת תגובות מבניות ותרמודינמיקה של חלבון ללחץ. הניסויים בלחץ גבוה שנרשמו כאן ב- RRM2 מראים כי וריאציות גדולות בערכי ΔVU, המעידות על שיתוף פעולה לא מלא, ניתן למצוא בחלבון תחום יחיד קטן יחסית. תמונה דומה עולה מניתוח שינויים בשינויים כימיים של 1H תחת לחץ….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי כספים מקרן הצדקה רוי ג’יי קארבר לג’וליאן רוש. אנו מודים לג’יי.די. לבנגוד ו-ב.ס. טולברט על שסיפקו בחביבות את דגימת RRM2.
Materials
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
- Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
- Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
- Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
- Ishima, R. CPMG relaxation dispersion. Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).
- Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins’ behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
- Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
- Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
- Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
- Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561 (2017).
- Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).
- Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
- Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. 生物化学. 40, 8665-8671 (2001).
- Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
- Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
- Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. 生物化学. 51, 9535-9546 (2012).
- Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
- Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
- Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).
- Goddard, T. D., Kneller, D. G. . Sparky 3. , (2010).
- Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
- Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
- Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
- Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
- de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
- Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).
