Um sistema otimizado de O9-1/Hidrogel para estudar sinais mecânicos em células de crista neural

As células de crista neural (NCCs) são um grupo de células-tronco durante a embriogênese vertebrada com uma notável capacidade de migrar e contribuir para o desenvolvimento de vários órgãos e tecidos. Os NCCs podem se diferenciar em diferentes tipos celulares, incluindo neurônios sensoriais, cartilagem, osso, melanócitos e células musculares lisas, dependendo da localização de origem axial e da orientação ambiental local da NCC^1,2. Com a capacidade de se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares, anormalidades genéticas que causam a desregulação em qualquer estágio do desenvolvimento da crista neural (NC) podem levar a inúmeras doenças congênitas². Por exemplo, perturbações durante a formação, migração e desenvolvimento de DCNT levam a distúrbios do desenvolvimento conhecidos coletivamente como neurocristopatias^1,3. Essas doenças vão desde defeitos craniofaciais devido à falha na formação do CCN, como a síndrome de Treacher Collins, até o desenvolvimento de vários cânceres devido à capacidade migratória metastática do CCN, como visto no melanoma^3,4,5,6. Ao longo das últimas décadas, pesquisadores fizeram descobertas notáveis sobre os papéis e mecanismos das DCNT no desenvolvimento e nas doenças, com a maioria dos achados sendo focados em sinais químicos^7,8. Mais recentemente, os sinais mecânicos foram indicados para desempenhar um papel crítico, mas mal compreendido no desenvolvimento do NCC^9,10.

As sugestões ambientais das DCNT desempenham um papel crítico durante o seu desenvolvimento, incluindo a regulação da diferenciação do NCC em vários tipos de células. As sugestões ambientais, por exemplo, as pistas físicas, influenciam comportamentos fundamentais e respostas celulares, como a diversificação funcional. A mecanotransdução permite que as células osenceram e respondam a essas pistas para manter vários processos biológicos². As NCCs são cercadas por células vizinhas e substratos diferentes, como a matriz extracelular (ECM), que pode dar origem a estímulos mecânicos para manter a homeostase e se adaptar às mudanças através da determinação do destino, proliferação e apoptose¹¹. A mecanotransdução começa na membrana plasmática onde ocorre o componente sensorial dos estímulos extracelulares mecânicos, resultando na regulação intracelular da célula¹². Integrinos, aderências focais e junções da membrana plasmática retransmitem sinais mecânicos, como forças de corte, estresse e rigidez de substratos circundantes, em sinais químicos para produzir respostas celulares¹². O retransmissamento de sinais químicos da membrana plasmática para a regulação celular final é realizado através de diferentes vias de sinalização para finalizar processos vitais para o organismo, como a diferenciação.

Vários estudos sugerem que a sinalização mecânica da rigidez do substrato desempenha um papel na diferenciação celular^13,14. Por exemplo, estudos anteriores mostraram que as células-tronco mesenquimais (MSCs) cultivadas em substratos macios com rigidez semelhante à do tecido cerebral (na faixa de 0,1-1,0 kPa) resultaram na diferenciação celular neuronal^15,16. No entanto, mais MSCs se diferenciam em células semelhantes a miócitos quando cultivados em substratos de 8-17 kPa imitando a rigidez do músculo, enquanto a diferenciação semelhante ao osteoblasto foi observada quando os MSCs foram cultivados em substratos rígidos (25-40 kPa)^15,16. A significância da mecanotransdução é destacada pelas irregularidades e anormalidades na via de sinalização mecânica que potencialmente levam a graves defeitos e doenças do desenvolvimento, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e osteoporose^17,18,19. Nos cânceres, o tecido mamário normal é macio, e o risco de câncer de mama aumenta em tecido mamário rígido e denso, um ambiente mais parecido com os tumores mamários¹⁵. Com esse conhecimento, os efeitos da sinalização mecânica no desenvolvimento do NCC podem ser estudados através da simples manipulação da rigidez do substrato através de um sistema in vitro, proporcionando mais vantagens e possibilidades na compreensão dos fundamentos da progressão e etiologia da doença relacionada à NC.

Para estudar o impacto dos sinais mecânicos nas NCCs, estabelecemos um sistema in vitro eficiente para NCCs com base na otimização de métodos publicados anteriormente e na avaliação das respostas das NCCs a diferentes sinais mecânicos^20,21. Foi fornecido um protocolo detalhado para a preparação e avaliação da rigidez do hidrogel variado e a avaliação do impacto da sinalização mecânica em NCCs. Para isso, os NCCs O9-1 são utilizados como modelo nc para estudar os efeitos e mudanças em resposta a hidrogéis rígidos versus macios. Os NCCs O9-1 são uma linha de células NC estável isolada do embrião do rato (E) no dia 8.5. Os NCCs O9-1 imitam NCCs in vivo porque podem se diferenciar em vários tipos de células derivadas do NC em mídia de diferenciação definida²². Para estudar a sinalização mecânica das NCCs, foi fabricado um substrato matricial com elasticidade tunable a partir de diferentes concentrações de acrilamida e soluções de biscrilamida para alcançar a rigidez desejada, correlacionando-se com a rigidez biológica do substrato^20,21,23. Para otimizar as condições do substrato matricial para NCCs, especificamente células O9-1, foram feitas modificações a partir do protocolo²⁰publicado anteriormente. Uma mudança feita neste protocolo foi a incubação de hidrogéis em colágeno I, diluídos em ácido acético de 0,2% em vez de 50 mM HEPES, a 37 °C durante a noite. O baixo pH do ácido acético leva a uma distribuição homogênea e maior incorporação de colágeno I, permitindo assim um apego mais uniforme da proteína ECM²⁴. Além disso, foi utilizada uma combinação de soro de cavalo e soro bovino fetal (FBS) nas concentrações de 10% e 5% em soro tampão de fosfato (PBS), respectivamente, antes de armazenar os hidrogéis na incubadora. O soro de cavalo foi utilizado como suplemento adicional à FBS devido à sua capacidade de promover a proliferação celular e a diferenciação na concentração de 10%²⁵.

Com este método, um ambiente biológico foi imitado pelo revestimento proteico ECM (por exemplo, Colágeno I) para criar um ambiente in vitro preciso para que os NCCs cresçam e sobrevivam^{a 20,21}. A rigidez dos hidrogéis preparados foi analisada quantitativamente via microscopia de força atômica (AFM), uma técnica bem conhecida para retratar o módulo elástico²⁶. Para estudar o efeito de diferentes níveis de rigidez em NCCs, as células do tipo selvagem O9-1 foram cultivadas e preparadas em hidrogéis para a coloração de imunofluorescência (IF) contra a actina filamentosa (F-actin) para mostrar as diferenças na adesão celular e morfologias em resposta às mudanças na rigidez substrato. Utilizando esse sistema in vitro, os pesquisadores poderão estudar os papéis da sinalização mecânica em NCCs e sua interação com outros sinais químicos para obter uma compreensão mais profunda da relação entre NCCs e sinalização mecânica.