신경 문장 세포에서 기계적 신호를 연구하기 위한 최적화된 O9-1/하이드로겔 시스템

신경 문장 세포 (NCC)는 다양한 장기및 조직의 개발에 기여하고 마이그레이션하고 기여하는 놀라운 능력을 가진 척추 동물 배아 발생 시 줄기 세포의 그룹입니다. NCC는 감각 뉴런, 연골, 뼈, 멜라닌세포 및 원활한 근육 세포를 포함한 상이한 세포 유형으로 분화할 수 있으며, 축 기원의 위치와 NCC^1,2의 국소 환경 지침에 따라 분화할 수^있다. 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력으로, 신경 문장(NC) 발달단계에서 난독증을 유발하는 유전적 이상이 수많은 선천성 질환으로 이어질 수^{있다 2.} 예를 들어, NcC의 형성, 이동 및 발달 중 의 혼란은 신경^{근증증1,3로}통칭되는 발달 장애로 이어진다. 이러한 질병은 트리처 콜린스 증후군과 같은 NCC 형성의 실패로 인한 두개골 면결에서 부터 흑색종^{3,4,5,6에서}볼 수 있듯이 NCC 전이성 철새 능력으로 인한 다양한 암의 발달에 이르기까지 다양하다. 지난 수십 년 동안, 연구원은 개발 및 질병에 있는 NcC의 역할 그리고 기계장치에 관하여 현저한 발견을 했습니다, 사실 인정의 대다수는 화학^신호에집중되고 있는^7,8. 최근에는 NCC 개발^9,10에서기계적 신호가 중요하지만 제대로 이해되지 않은 역할을 하도록 지시되었습니다.

NCC의 환경 단서는 다양한 세포 유형으로 NCC 분화의 규제를 포함하여 개발 중에 중요한 역할을합니다. 환경 단서, 예를 들어, 물리적 단서, 기능 적 다양화와 같은 중추적 인 행동 및 세포 반응에 영향을 미칩니다. 메카노트랜스듀션은 세포가 다양한 생물학적 과정을 유지하기 위해 이러한 단서를 감지하고 반응할 수^{있도록 2.} NCC는 세포외 매트릭스(ECM)와 같은 주변 세포 및 상이한 기판에 둘러싸여 있어 항상성을 유지하고 운명 결정, 증식 및 세포멸을 통해 변화에 적응하기 위해 기계적 자극을 야기할 수^있다. 메카노트랜스듀션은 기계적 세포외 자극의 감각 성분이 발생하는 플라즈마 멤브레인에서 시작하여^{세포(12)의}세포내 조절을 초래한다. 플라즈마 멤브레인의 통합, 초점 접착 및 접합부는 전단력, 응력 및 주변 기판의 강성과 같은 기계적 신호를 화학 신호로 전달하여 세포^{반응(12)을}생성한다. 플라즈마 멤브레인에서 최종 세포 조절에 이르는 화학 신호의 릴레이는 분화와 같은 유기체에 대한 중요한 프로세스를 마무리하기 위해 상이한 신호 경로를 통해 수행됩니다.

몇몇 연구 결과는 기질 강성에서 기계신호가 세포 분화^13,14에있는 역할을 한다는 것을 건의했습니다. 예를 들어, 이전 연구는 뇌 조직의 강성과 연약한 기판에서 자란 중간엽 줄기 세포(MSC)가 뇌 조직(0.1-1.0 kPa 범위)과 유사한 강성을 가진 것으로 나타났으며, 그 결과 뉴런 세포^{분화(15,16)가}발생한것으로 나타났다. 그러나, 더 많은 MSC는 근육의 강성을 모방8-17 kPa 기판에 성장할 때 근구와 같은 세포로 분화하고, MSC가 뻣뻣한 기판 (25-40 kPa)에 배양될 때 골세포와 같은 분화를 관찰하였다^15,16. 메카노트랜스덕션의 중요성은 잠재적으로 암, 심혈관 질환 및골다공증^17,18,19를포함한 심각한 발달 결함 및 질병으로 이어질 수 있는 기계적 신호 경로의 요철 및 이상에 의해 강조된다. 암에서는 정상적인 유방 조직이 연약하며 유방암의 위험은 뻣뻣하고 조밀한 유방 조직에서 증가하며, 유방 종양에 더 유사한^환경(15). 이러한 지식을 바탕으로 NCC 발달에 대한 기계적 신호의 효과는 체외 시스템을 통해 기질 강성의 간단한 조작을 통해 연구될 수 있으며, NC 관련 질병 진행 및 병인학의 기초를 이해하는 데 있어 추가적인 이점과 가능성을 제공한다.

NcC에서 기계 신호의 영향을 연구하기 위해, 우리는 이전에 발표 된 방법의 최적화및 다른 기계적^{신호20,21에}대한 NcC의 응답의 평가를 기반으로 NcC에 대한 효율적인 시험관 시스템을 설립했다. 다양한 하이드로겔 강성 제제 및 NNC에서 의 기계적 신호의 영향에 대한 평가를 위한 상세한 프로토콜이 제공되었습니다. 이를 위해 O9-1 NCC는 NC 모델로 활용되어 경직대 소프트 하이드로겔에 대한 반응으로 효과와 변화를 연구한다. O9-1 NCC는 8.5일째에 마우스 배아(E)로부터 분리된 안정적인 NC 세포주이다. O9-1 NcC는 정의된 분화^{매체(22)에서}다양한 NC 유래 세포 유형으로 분화할 수 있기 때문에 생체 내에서 NcC를 모방한다. NcC의 기계적 신호를 연구하기 위해, 매트릭스 기판은 생물학적기질 강성(20,^21,23)과상관관계가 있는 원하는 강성을 달성하기 위해 아크릴아미드및 비스 아크릴아미드 용액의 다양한 농도로부터 튜닝 가능한 탄성으로 제조되었다. NcC, 특히 O9-1 셀에 대한 매트릭스 기판의 조건을 최적화하기 위해 이전에 게시된^{프로토콜(20)에서}수정하였다. 이 프로토콜에서 한 가지 변화는 콜라겐 I에서 하이드로겔을 배양하는 것이었는데, 50m HEPES 대신 0.2% 아세트산으로 희석되어 하룻밤 사이에 37°C에서 이루어졌다. 아세트산의 낮은 pH는 균일한 분포와 더 높은 콜라겐 I 통합으로 이어지므로 ECM^{단백질(24)의}보다 균일한 부착을 가능하게 한다. 또한, 말 혈청과 태아소 혈청(FBS)의 조합은 인큐베이터에 하이드로겔을 저장하기 전에 인산염 완충식염수(PBS)에서 각각 10% 및 5%의 농도에서 사용되었다. 말 혈청은 10%^25의농도에서 세포 증식 및 분화를 촉진하는 능력으로 인해 FBS에 대한 추가 보충제로 사용되었다.

이 방법으로, 생물학적 환경은 ECM 단백질 코팅(예를 들어, 콜라겐 I)에 의해 모방되어^{NcC가 20,21로}성장하고 생존할 수 있는 정확한 체외 환경을 조성하였다. 준비된 하이드로겔의 강성은 탄성 계수를 묘사하는 잘 알려진 기술인 원자력 현미경검사(AFM)를통해 정량적으로 분석되었다. NcC에 대한 상이한 강성 수준의 효과를 연구하기 위해 야생형 O9-1 세포는 기판 강성의 변화에 대응하여 세포 접착및 형태학의 차이를 보여주기 위해 면역형 형광(IF)을 위한 하이드로겔에 배양및 제조되었다. 이 체외 시스템을 활용하여 연구자들은 NcC에서 기계 신호의 역할과 다른 화학 신호와의 상호 작용을 연구하여 NcC와 기계 신호 사이의 관계를 더 깊이 이해할 수 있습니다.