マウス腎臓の インビボ 分析のための3Dロボット超音波の使用

このプロトコルのすべてのステップは、メイヨークリニック(ミネソタ州ロチェスター)の動物使用ガイドラインに準拠しており、メイヨークリニック施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。 1. 動物モデル 市販の供給源からマウスを入手してください。注:C57BL/6J(年齢=18ヶ月;n = 22(男性7人、女性15人))(材料表)およびPkd1(RC/RC)( 年齢= 18ヶ月;n = 9(男性3人、女性6人))4 が研究に使用された。 2.脱毛 麻酔室で気化したイソフルラン(2%〜3%)を用いて動物を麻酔する。つま先のピンチを実行して、動物が十分に麻酔されていることを確認してください。マウスが約 60 ~ 90 回の呼吸/分の速度で呼吸していることを確認し、明らかな空気のガルピングがないことを確認します。注:気化イソフルランは、動物の麻酔レベルを制御および微調整する能力のために選択されました。酸素100%と混合したイソフルランが利用された。 電気カミソリを使用して、米国の測定に必要な皮膚領域を剃ります。注:この研究では、腎臓と心臓の測定に焦点を当てているため、動物の胸と背中を剃りました。 脱毛クリームを綿の先端のアプリケーターで動物の剃った皮膚に塗布する。30〜60秒後に乾いたペーパータオルを使ってクリームを拭き取ってください。その後、湿ったガーゼパッドを用いて脱毛クリーム残渣を拭き取り続ける。スキャンを開始する前に、脱毛が完了していることを確認してください。注:残りの髪の毛は画質に干渉します。完全な脱毛は非常に重要です。しかし、動物の皮膚を傷つけるのを防ぐために、1分以内に脱毛クリームを拭き取る必要があります。動物の残りの脱毛クリームは、米国機械のイメージング膜を染色する可能性があります。濡れたガーゼパッドを使用して動物の適切な清掃を確認してください。 3. 動物のポジショニング US マシンと、US ベイの内部発熱体のスイッチをオンにします。使用する対応する米国のベイに適した麻酔バルブをオンにします。メモ:イメージングUSソフトウェアを起動する前に、USマシンの電源を入れる必要があります。 湾を膜を覆うのに十分な水で満たしてください。麻酔をかけた動物を鼻円錐形に置きます。 心臓測定のために、動物を臆病な位置に置き、それを約30°右に傾けます。 腎臓の測定のために、動物をまっすぐで仰臥位に置きます。動物の体を静かに平らにして、動物と膜の間のエアポケットを最小限に抑えます(図1B)。注:動物の体のそばに指を走らせると、皮膚に付着している気泡を取り除くことができ、イメージングが妨げられます。米国培地として水または米国生理食塩水ゲルを使用する。しかし、水はここで議論された迅速なイメージングを容易にします。 4. 超音波測定 イメージングUSソフトウェアで、 US集録 を選択し、計測器を初期化します。 Bモードを用いた腎臓イメージング。 適切なダイアログボックスにスタディの名前を入力します。 適切なダイアログボックスに動物IDを入力します。注:最大3匹の動物を順番に画像化できます。 3Dというラベルの付いたタブをクリックして、 3D スキャンを初期化します。 ライブ カメラ フィードを使用して、関心領域 (ROI) ボックスを移動して腎臓を含めます。注:ROIのサイズは、画像ターゲットのサイズに応じて調整することができる。ROIのサイズを大きくすると、スキャン時間がわずかに長くなります(図1C)。ROIサイズに応じて、スキャナは探触子がROI全体をスキャンするために必要なパス数を自動的に調整します。 希望する画像のタイプに応じて、 リニアアレイ または ウォブラーを選択して探触子を選択します。 高速スキャン またはいずれかの探触子用に 最適化 から選択します。メモ: リニアアレイはより高速で、通常は適切なイメージングを提供します。ウォブラートランスデューサは、リニアアレイで所望の画質を獲得できない場合に利用することができる。ウォブラー探触子は、より高い周波数波長を利用するため、画像でより多くの精細度を提供します。高速スキャンオプションは、呼吸補正なしで中品質の画像を高速で取得します。「最適化」オプションは、もう少し時間がかかりますが、画質が向上し、呼吸補正が可能になります。この原稿では、最適化された線形配列プリセットの使用に焦点を当てます。 ライブビューをクリックすると、目的の表示領域の ライブ 画像が表示されます。 探触子を移動するには、円形の [移動先 ]ボタンをクリックし、画像化するマウスの領域をクリックします。所定のステップサイズの方向矢印を使用して、探触子の位置を微調整します。 コントロールパネルウィンドウの横にある矢印をクリックして、設定トレイを開きます。[スキャンプロトコル]をクリックして、スキャン設定を開きます。 理想的な焦点深度を決定し、TGC(タイムゲイン補正)のスライダーを調整して、腎臓を最もよく見るように画像コントラストを変更します。目的の設定が完了したら、矢印をもう一度クリックして 設定トレイを閉じます。 スタティック取得ボタンを押して、3Dスキャンを開始します。メモ:スキャンの進行状況は、ソフトウェアの左下にあるプログレスバーに表示されます。 スキャンが完了したら、青いダウンロード矢印をクリックして プレビューモードでスキャンを開き、画質を確認します。スキャンの 3D フレーム間を移動するには、ウィンドウの上部にある赤い矢印をドラッグします。ズームインまたはズームアウトするには、Ctrl キー を押し ながらマウスのスクロール ボタンを使用します。 追加の動物をスキャンするには、動物IDダイアログボックスを更新し、新しいIDを入力してから、上記の手順を繰り返します。注:スキャンが完了したら、動物を乾かして自宅のケージに戻してください。 Mモードを用いた心臓イメージング。注:Mモードは、特定の選択された超音波ラインに沿った超音波の表示です。 [Mモード]タブをクリックして、心臓イメージングを有効にします。注: 一度に画像化できる動物は 1 匹だけです。 動物が心臓スキャンに適した位置にあることを確認します(ステップ2.2)。ROIを心臓のおおよその位置に移動します。 ハートファインダーボタンを押して心臓を見つけます。ヒートマップを使用して、探触子の位置を最適化します。円形の[移動]ボタンを使用して、トランスデューサを左心室に移動します(図2A)。 ライブビューに移動し、矢印ボタンを使用して乳頭筋の間に探触子を配置します(図2B)。探触子が正しく配置されていることを確認するには、ライブMモードトレースを表示します(図2D)。 探触子が適切な位置になったら、 シーケンスの集録をクリックします。青いダウンロード矢印をクリックして、完了したスキャンを表示します。 5. 腎臓解析(解析力学) [画像 解析 ]タブを開き、[ ボリュームのロード] ボタンを選択して、画像ファイル/フォルダを入力します。 セグメンテーション さまざまな平面を表す色付きの線を移動して、すべての平面で腎臓を見つけます。 [ 追加 ] をクリックして、新しいセグメンテーションを追加します。ファイルのマークアップ名を指定します。 [サーフェスカット]ボタンを使用して、複数の平面で腎臓の外縁の周りにポイントを追加します。[適用]をクリックして、腎臓全体にわたってセグメンテーションを生成します(図3A)。 各平面の異なるフレームをスクロールし、[編集]をクリックしてポイントを正しい場所にドラッグして、不正確な領域 を編集し ます。 または、腎臓の形状が不規則な場合は、 Draw 関数を使用して、腎臓の周りに不規則な形状の痕跡を作成します。エッジの周りのポイントをクリックするか、左クリックを押したままにしてトレースをフリーハンドで描画します。 [描画] ボタンでトレースを完了するには、マウスで右クリックします。複数のフレーム先にスクロールし、トレース処理を繰り返します。 対象領域全体でフレームがトレースされるまで繰り返します。 「描画」機能を使用する場合は、「スライス間で塗りつぶし」を選択してトレースを確認および調整します。[初期化]をクリックしてプレビューを表示します。プレビューが受け入れられる場合は、[適用]をクリックします。そうでない場合は、[キャンセル]をクリックしてトレースを変更します。メモ: [消去] ボタンを使用すると、トレース内の領域を削除できます。 「滑らか」 ボタンは、トレースのギザギザのエッジを滑らかにします。 画像解析に問題がなければ、[ 保存 ] を選択して解析を元の画像ファイルに保存します。 測定 キャリパー関数を使用して、画像内のフィーチャを測定します。「キャリパー」ボタンをクリックし、測定する距離の2点を左クリックします(図3B)。 画面上部のディスクボタンをクリックして、測定値を保存します。 6. 心臓分析 「ボリュームのロード」を選択して、分析するファイルを入力します。 [追加] オプションを選択します。 ポイント配置ツールを使用して、心臓組織の各層の収縮期と拡張期をトレースします。心臓組織の他の層で続行します。Edit機能を使用してトレースを変更します(図2C、D)。メモ: M モードトレースが非常に明確な場合は、[ 追加 (自動) ] ボタンを使用して、各レイヤーのトレースを自動的に生成します。 [適用] を選択して、心臓パラメーターを計算します。「定量化」タブを表示し、「統計のエクスポート」を選択して、すべてのデータを *.csv ファイルとしてエクスポートします (図 2E)。