שימוש באולטרסאונד רובוטי 3D לניתוח In Vivo של כליות עכבר
Summary
פרוטוקול זה מדגים אולטרסאונד רובוטי (ארה”ב) כחלופה מעשית, חסכונית ומהירה לשיטות תמונה מסורתיות לא פולשניות.
Abstract
שיטות נפוצות להדמיית ויוו של מכרסמים כוללות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET), טומוגרפיה ממוחשבת (CT), הדמיית תהודה מגנטית (MRI) ואולטרסאונד (ארה”ב). לכל שיטה מגבלות ויתרונות, לרבות זמינות, קלות שימוש, עלות, גודל ושימוש בקרינה מייננת או בשדות מגנטיים. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בארה”ב רובוטית תלת-ממדית להדמיית ויוו של כליות מכרסמים ולב, ניתוח נתונים עוקב ויישומי מחקר אפשריים. יישומים מעשיים של ארה”ב רובוטית הם כימות נפח הכליות הכולל (TKV), כמו גם מדידת ציסטות, גידולים וכלי דם. למרות שהרזולוציה אינה גבוהה כמו שיטות אחרות, ארה”ב הרובוטית מאפשרת איסוף נתונים מעשי יותר של תפוקה גבוהה. יתר על כן, באמצעות הדמיה במצב M בארה”ב, תפקוד הלב עשוי להיות מכמת. מאז הכליות לקבל 20%-25% של תפוקת הלב, הערכת תפקוד הלב הוא קריטי להבנת פיזיולוגיה של הכליות ופתולוגיה.
Introduction
השיטות הנפוצות ביותר להדמיית מכרסמים ב- vivo כוללות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET), הדמיה אופטית (OI), טומוגרפיה ממוחשבת (CT), הדמיית תהודה מגנטית (MRI) ואולטרסאונד (ארה”ב). טכניקות אלה מספקות רזולוציה גבוהה בתמונות vivo, ומאפשרות לחוקרים להעריך כמותית ולעקוב לאורך מודלים של מחלות באופן לא פולשני1. בעוד שלכל שיטת הדמיה יש מגבלות, הן מספקות גם כלים יקרי ערך למחקר פרה-קליני.
כאן, המחקר מפרט מערכת אמריקאית ומציג את הפרוטוקול להדמיית מכרסמים רובוטיים ותלת-ממדיים. גלי ארה”ב מיוצרים על ידי גשושית הנקראת מתמר, אשר בדרך כלל מוחזק ביד. גלי קול משתקפים בחזרה כשהם מתקשרים עם רקמות, וההדים משוחזרים לתמונות2. הפרוטוקול המתואר כאן יתמקד בהדמיית כליות ולב באמצעות מתמר בשליטה רובוטית ושימוש בתוכנה המאפשרת שחזור תלת-ממדי מהיר להערכה כמותית.
ארה”ב הרובוטית היא שיטת הדמיה מהירה, אמינה ולא פולשנית המאפשרת לחוקרים לבצע מחקרים בעלי תפוקה גבוהה ואורך. בהשוואה לשיטות אמריקאיות ידניות, השיטה הרובוטית של ארה”ב יעילה בזמן, שכן ניתן לסרוק עד שלושה בעלי חיים תוך דקות ספורות. תפוקה גבוהה עבור מדידות כליות עולה כי עד 20 עכברים לשעה ניתן לדמיין. המתמרים הרובוטיים ממוקמים מתחת לממברנות האקוסטיות ונעים באופן עצמאי מבעל החיים עם שתי דרגות חופש (איור 1A). הדבר מאפשר למשתמשים מתחילים להשיג תמונות באיכות גבוהה, בעוד ששיטות אמריקאיות ידניות רגישות יותר לשגיאות משתמש. התוכנה המשולבת מאפשרת שחזור כליות תלת-ממדי יעיל בזמן אמת. בעבר, הדמיית תהודה מגנטית (MRI) הייתה שיטה נפוצה להדמיה לא פולשנית בשל ניגודיות מעולה של רקמות רכות, חוסר רדיואקטיביות ועומק חדירה. עם זאת, MRI דורש לעתים קרובות זמני רכישה ארוכים והוא יקר לביצוע. ארה”ב הוערכה כחלופה אמינה ומהירה יותר ל- MRI בהערכת נפח הכליות הכולל (TKV)3.
Protocol
Representative Results
Discussion
אולטראסאונד משתמש בגלי קול, וכל מחסומים להתפשטות גלי קול יפריעו לאיכות התמונה. לכן, הסרת שיער מלאה של האזור להיות בתמונה היא קריטית. חשוב גם להבטיח הסרה מלאה של קרם depilatory כפי שהוא יכול לגרום כוויות / גירוי של העור של החיה ושינוי צבע הקרום השקוף של הסורק. רמות מים נאותות במפרצים נחוצות להפצת גלי קול אופטימלית, ולכן נדרשים לקבלת רזולוציית התמונה הגבוהה ביותר. עם זאת, כאשר החיה נמצאת במצב נוטה, ודא שהחוטם של החיה נמצא מעל מפלס המים או שבעל החיים נמצא בסיכון לשאיפת מים. אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה, במיוחד עומק מוקד, היא קריטית להשגת תמונות באיכות גבוהה. שינויים בפרמטרים עשויים להיות נחוצים עבור בעלי חיים בודדים.
ארה”ב הרובוטית מספקת יתרונות רבים על פני שיטות מסורתיות של ארה”ב המוחזקות ביד. ראשית, המערכת משתמשת בממשק פשוט המבוסס על מצלמה של הצבעה ולחיצה. תכונה זו מטפלת במורכבות של ארה”ב הקונבנציונלית ומייצרת נתונים עקביים גם כאשר היא מופעלת על ידי משתמש טירון6. שנית, המערכת מאפשרת שימוש במים ולא בג’ל אמריקאי מסורתי כאמצעי אקוסטי. בעבר, השימוש בג’ל אמריקאי אפשר היווצרות של בועות שהפריעו לרכישת תמונה איכותית. כמו כן, הג’ל האמריקאי מבולגן ומספק אתגרים לניקוי. יתר על כן, המים מחוממים על ידי מנורת החום ומסייעים בשמירה על טמפרטורת הגוף של החיה. שלישית, ארה”ב הרובוטית מהירה יותר, כך שממצאים מתנועה נשימתית אינם בעייתיים. מהירות ההדמיה המוגברת מאפשרת השלמה מעשית של איסוף נתוני תפוקה גבוהה. רביעית, ארה”ב הרובוטית משיגה תמונות תלת-ממדיות, ולכן הופכת את השחזור התלת-ממדי של עצמים לפשוט (איור 4). MRI ושיטות אחרות הן יקרות, גוזלות זמן רב, ולא תמיד זמינות. חשוב לציין, המערכת הרובוטית בארה”ב מתאימה לשולחן או לספסל והיא חסכונית יותר. לבסוף, עבודה קודמת הראתה כי רובוטית ארה”ב יכולה לספק נתוני מדידה דומים לאמצעים יקרים יותר, כגון MRI3.
בעוד שאיכות התמונה והרזולוציה של המערכת הרובוטית בארה”ב המתוארת בעבודה זו היו מתאימות ליישום המוצע (איור 7), ישנן מספר דרכים שבהן ניתן לשפר את איכות התמונה בעתיד. לדוגמה, שימוש במתמרים בתדר גבוה יותר (לדוגמה, 50-70 מגה-הרץ) יביא לתמונות ברזולוציה גבוהה יותר עם הגדרת תכונה טובה יותר. בעוד ניצול תדרים גבוהים יותר יגרום עומק נמוך יותר של חדירה, התמונות צריכות להיות מספיק עבור הדמיה in vivo של איברים שטחיים, כגון כליות העכבר. בדומה לאמצעי הדמיה אחרים, ניתן להשתמש בחומרי ניגודיות כדי לשפר תכונות ספציפיות. עבור ארה”ב, זה בדרך כלל אומר באמצעות משהו מאוד רפלקטיבי של גלי קול. מיקרו-בועות תוך-וסקולריות שבהן שומנים מקיפים בועות גז קטנות מאוד הם סוכן אחד כזה. בועות הגז בגודל מיקרון הן רפלקטיביות מאוד ובכך מספקות אות ברור שני המתרגם לרזולוציה גבוהה של כלי דם7. בעוד טכניקת ניגודיות אקוסטית זו עשויה להיות שימושית למדי, זה יכול להיות כמה חסרונות. ראשית, microbubbles חייב להיות עשה טרי רק להתמיד vivo במשך 5-10 דקות. שנית, בהזרקה תוך וסקולרית vivo בדרך כלל דורש צנתור רעלת זנב להזרקה, וזה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. בנסיבות מסוימות ומשטרים פועמים, הדמיית מיקרו-בועות יכולה בעצמה להוביל לנזק לכלי דם בכליות8.
יש גם כמה מגבלות כלליות יותר של המערכת האמריקאית המסוימת המשמשת. ראשית, רק מערך ליניארי אחד (ממורכז ב- 18 מגה-הרץ) נכלל במארז הרובוטי, כך שהמעבר לבדיקות בתדר גבוה או נמוך יותר אינו אפשרי כעת. הדבר עשוי להשפיע על רוחב המודלים (גדולים או קטנים יותר) שניתן להעריך עם המערכת. איטרציות עתידיות של המכשיר צריכות לכלול מערכים ליניאריים מרובים כדי לכסות את המגוון המלא של דגמים פרה-קליניים של בעלי חיים. שנית, לא ניתן לשלוט בזווית המתמר ביחס לנושא החי. לכן, ביצוע טכניקות הדמיה תלויות זווית, כגון דופלר, או השגת תצוגות חלופיות במישור של איברים מסוימים (למשל, ראיית ציר ארוכה של הכליות) דורש מיקום מחדש של החיה ויכול להיות קשה להשגה. ניתן להוסיף דרגות חופש נוספות לתנועה הרובוטית כדי לשפר את האתגר הזה. שלישית, מדי פעם, צפינו בממצאי הדהוד הנובעים מהקרום האקוסטי המפריד בין החיה למתמר שיכול לטשטש הדמיה של תכונות וגבולות שטחיים. במקרים אלה, באמצעות תיקו ג’ל כדי לרומם את החיה מן הממברנה יכול לתקן את המצב. לבסוף, בקרת טמפרטורה באמצעות מנורת חום אינה מדויקת, ולכן יש להקדיש תשומת לב רבה לטמפרטורת הגוף המרכזית של החיה בזמן ההדמיה. מנגנוני חימום מבוקרים יותר, כגון כרית חימום משולבת, ישפרו ככל הנראה את ניהול ההומוסטזיס ואת תפוקת ההדמיה.
השימוש ברובוטיקה ארה”ב עשוי לחול על תחומי מחקר שונים. טכנולוגיה זו מאפשרת הדמיה של מבני רקמות ברוטו, ובכך ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול וטיפולים פוטנציאליים6,9, כמו גם מורפולוגיה כליות כפי שמוצג כאן. היכולת לפלח את התכונות הספציפיות של התמונות הופכת אותו לכלי אטרקטיבי לחקר מודלים של מחלת כליות פוליציסטית (PKD)3. תמונות במצב M מאפשרות כימות פשוט של פרמטרים לבביים חשובים רבים המאפשרים הערכת vivo של פיזיולוגיה לבבית. כמו הכליות לקבל 20%-25% של תפוקת הלב10, הבנת תפקוד הלב במהלך ההערכה האורך של פתולוגיה כליות חשוב. באמצעות פרוטוקולים אלה בארה”ב, ניסינו להמחיש כי הדמיה בארה”ב היא לא רק מעשית עבור מחקרי כליות vivo ואורך, אלא גם כי יותר ויותר כלים בארה”ב לאפשר הן הערכה מורפולוגית, כמו גם פיזיולוגית של עכברים במחקרים פרה-קליניים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH (R43-DK126607, TJC, TLK, MFR) וקרן מאיו.
Materials
| Electric Razor | Braintree Scientific, Inc | CLP-9868 14 | |
| C57bk6j | The Jackson laboratory | https://www.jax.org/ | |
| Cotton gauze pads | Fisher Scientific | ||
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | ||
| Depilatory cream | N/a | N/a | This study used Nair |
| Heat lamp | Included with SonoVol Vega system | ||
| Robotic Ultrasound System | SonoVol Inc | SonoVol Vega system includes anesthesia system | |
| SonoEQ Software | SonoVol | Included with SonoVol Vega system | |
| TERRELL Isoflurane | Piramal Critical Care, Inc | NDC 66794-019-10 |
References
- Cunha, L., et al. Preclinical imaging: an essential ally in modern biosciences. Molecular Diagnostics & Therapy. 18 (2), 153-173 (2014).
- Ultrasound. NIBIB Available from: https://www.nibib.nih.gov/science-education/science-topics/ultrasound#pid-936 (2016)
- Beaumont, N. J., et al. Assessing polycystic kidney disease in rodents: Comparison of robotic 3d ultrasound and magnetic resonance imaging. Kidney360. 1 (10), 1128-1136 (2020).
- Hopp, K., et al. Functional polycystin-1 dosage governs autosomal dominant polycystic kidney disease severity. The Journal of Clinical Investigation. 122 (11), 4257-4273 (2012).
- Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).
- Czernuszewicz, T. J., et al. A new preclinical ultrasound platform for widefield 3D imaging of rodents. Review of Scientific Instruments. 89 (7), 075107 (2018).
- Chong, W. K., Papadopoulou, V., Dayton, P. A. Imaging with ultrasound contrast agents: current status and future. Abdominal Radiology (NY). 43 (4), 762-772 (2018).
- Nyankima, A. G., Kasoji, S., Cianciolo, R., Dayton, P. A., Chang, E. H. Histological and blood chemistry examination of the rodent kidney after exposure to flash-replenishment ultrasound contrast imaging. Ultrasonics. 98, 1-6 (2019).
- Rojas, J. D., et al. Ultrasound measurement of vascular density to evaluate response to anti-angiogenic therapy in renal cell carcinoma. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 66 (3), 873-880 (2019).
- Boron, W. F., Boulpaep, E. L. . Medical Physiology. 3rd edn. , (2017).
