Summary

Groei, zuivering en titratie van oncolytisch herpes simplexvirus

Published: May 13, 2021
doi:

Summary

In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige methode van groei, zuivering en titratie van het oncolytische herpes simplex-virus voor preklinisch gebruik.

Abstract

Oncolytische virussen (OV’s), zoals het oncolytische herpes simplex-virus (oHSV), zijn een snel groeiende behandelingsstrategie op het gebied van kankerimmunotherapie. OP’s, waaronder oHSV, repliceren selectief in en doden kankercellen (sparen gezonde/normale cellen) terwijl ze antitumorimmuniteit induceren. Vanwege deze unieke eigenschappen worden oHSV-gebaseerde behandelingsstrategieën steeds vaker gebruikt voor de behandeling van kanker, preklinisch en klinisch, waaronder fda-goedgekeurde talimogene laherparevec (T-Vec). Groei, zuivering en titratie zijn drie essentiële laboratoriumtechnieken voor alle OVs, inclusief oHSV’s, voordat ze kunnen worden gebruikt voor experimentele studies. Dit artikel beschrijft een eenvoudige stapsgewijze methode om oHSV in Vero-cellen te versterken. Naarmate oHSV’s zich vermenigvuldigen, produceren ze een cytopathisch effect (CPE) in Vero-cellen. Zodra 90-100% van de geïnfecteerde cellen een CPE vertonen, worden ze voorzichtig geoogst, behandeld met benzonase en magnesiumchloride (MgCl2),gefilterd en onderworpen aan zuivering met behulp van de sucrose-gradiëntmethode. Na zuivering wordt het aantal infectieuze oHSV (aangeduid als plaquevormende eenheden of PFUs) bepaald door een “plaquetest” in Vero-cellen. Het hierin beschreven protocol kan worden gebruikt om hoog-titer oHSV-voorraad voor te bereiden op in vitro studies in celkweek en in vivo dierproeven.

Introduction

Oncolytische virussen (OV’s) zijn een opkomende en unieke vorm van kankerimmunotherapie. OP’s repliceren selectief tumorcellen in en lyse (sparende normale/gezonde cellen)1 terwijl ze antitumorimmuniteit induceren2. Oncolytisch herpes simplex-virus (oHSV) is een van de meest uitgebreid bestudeerde virussen onder alle OV’s. Het is het verst in de kliniek, met Talimogene laherparepvec (T-VEC) als eerste en enige OV die FDA-goedkeuring in de VS heeft ontvangen voor de behandeling van gevorderd melanoom3. Naast T-VEC worden veel andere genetisch gemanipuleerde oHSV’s preklinisch en klinisch getest bij verschillende kankertypen3,4,5,6,7,8. De huidige geavanceerde recombinante DNA-biotechnologie heeft de haalbaarheid van de engineering van nieuwe oHSV’s voor therapeutische transgene(n)3,5verder vergroot . Een efficiënt systeem van oHSV propagatie, zuivering en titer bepaling is van cruciaal belang voordat een (nieuw ontwikkelde) oHSV kan worden getest voor in vitro en in vivo studies. Dit artikel beschrijft een eenvoudige stapsgewijze methode van oHSV-groei (in Vero-cellen), zuivering (volgens de sucrose-gradiëntmethode) en titratie (door een oHSV-plaquetest in Vero-cellen) (Figuur 1). Het kan gemakkelijk worden aangenomen in elke bioveiligheid niveau 2 (BSL2) laboratoriuminstelling om een hoogwaardige virale voorraad voor preklinische studies te bereiken.

Vero, een Afrikaanse groene apenniercellijn, is de meest gebruikte cellijn voor oHSV-propagatie9,10,11,12,13 omdat Vero-cellen een defecte antivirale interferonsignaleringsroute hebben14. Andere cellijnen met inactivated stimulator of interferon genes (STING) signalering kunnen ook worden gebruikt voor oHSV-groei12,13. Dit protocol maakt gebruik van Vero-cellen voor oHSV-groei en plaquetest. Na vermeerdering worden met oHSV geïnfecteerde cellen geoogst, gelyseerd en onderworpen aan zuivering, waarbij gelyseerde cellen eerst worden behandeld met benzonasenuclease om gastheercel-DNA af te doen, nucleïnezuur-eiwitaggregatie te voorkomen en de viscositeit van het cellysaat te verminderen. Aangezien een goede activering van benzonase vaak Mg2+vereist , wordt in dit protocol mgCl2 1-2 mM MgCl2gebruikt . Het gastheercelresten van het met benzonase behandelde cellysaat worden verder geëlimineerd door seriële filtratie vóór snelle sucrose-gradiëntcentrifugatie. Een stroperig 25% sucrose-oplossingskussen helpt om een langzamere virusmigratie door de sacharoselaag te garanderen, waardoor gastheercelgerelateerde componenten in het supernatant achterblijven, waardoor de zuivering wordt verbeterd en virusverlies in de pellet wordt beperkt16. De gezuiverde oHSV wordt vervolgens getitreerd op Vero-cellen en virale plaques worden gevisualiseerd door Giemsa-kleuring17 of X-gal-kleuring (voor LacZ-codering van oHSV’s)18.

Protocol

1) oHSV groei OPMERKING: Zorg voor goedkeuring door het instellingscomité voor bioveiligheid voordat u met oHSV werkt. Deze studie werd uitgevoerd onder goedgekeurd IBC Protocol nr. 18007. Houd BSL2-voorzorgsmaatregelen in stand: bleek alle pipetten, tips, buizen en andere materialen die in contact komen met het virus. Spuithandschoenen met 70% isopropylalcohol voordat de handen de BSL2 celkweekkap verlaten. Was altijd grondig de handen met zeepwater na het werken met een virus. Op …

Representative Results

Een kort overzicht van het hele protocol is weergegeven in figuur 1, die de kritieke stappen vertegenwoordigt die betrokken zijn bij de groei, zuivering en titratie van oHSV. CPE in Vero-cellen kan al na 4 uur post-HSV-infectie worden gedetecteerd19. Figuur 2 toont CPE in Vero-cellen op drie verschillende tijdstippen na oHSV-infectie. Het niveau van de CPE wordt in de loop van de tijd verhoogd. In dit protocol wordt 90-100% CPE meestal wa…

Discussion

Het protocol begint met de groei van oHSV in low-passage Vero cellen. De samenvloeiing van de Vero-celmonolaag moet ~ 80% zijn op het moment van virusinenting, omdat overwoekerde cellen strakke vezelige structuren kunnen ontwikkelen die de oHSV-invoer in Vero-cellen kunnen verminderen20. Zodra 90-100% CPE is waargenomen, wordt het kweeksupernatant verwijderd, cellen geoogst, geresuspendeerd in VB/supernatant (zie stap 1.4.6), snap-frozen en opgeslagen bij -80 °C voor latere zuivering. Blaho en co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het onderzoek in het Saha lab werd mede ondersteund door fondsen van de DOD (W81XWH-20-1-0702) en Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin en Melissa R.M. Humphrey werden gedeeltelijk ondersteund door NIH (R01 CA160762).

Materials

1.7 mL centrifuge tubes Sigma CLS3620
15 mL polypropylene centrifuge tubes Falcon 352097
5 mL polypropylene tubes Falcon 352063
50 mL polypropylene centrifuge tubes Falcon 352098
6-well cell culture plates Falcon 353046
Benzonase Nuclease Sigma E8263-25KU
Cell scraper Fisher Scientific 179693
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Corning MT-10-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Corning MT-21-031-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007003
Giemsa Stain Sigma G3032
Glutaraldehyde Fisher Scientific 50-262-23
Glycerol Sigma G5516
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning MT-21-021-CV
High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline Sigma D4031
Human immune globulin Gamastan NDC 13533-335-12
Magnesium chloride Fisher Chemical M33-500
Media Sterilization filter, 250 mL Nalgene, Fisher Scientific 09-740-25E
Media Sterilization filter, 500 mL Nalgene, Fisher Scientific 09-740-25C
Neutral Red solution Sigma N4638
Paraformaldehyde Fisher scientific  15710S
Plate rocker Fisher 88861043
Potassium Ferricyanide Sigma P8131
Potassium Ferrocyanide Sigma P9387
Sodium chloride Fisher Chemical S271-3
Sorvall ST 16R Centrifuge ThermoFisher Scientific 75004381
Sorvall ST 21R Centrifuge ThermoFisher Scientific 75002446
Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher Scientific 02-681-371
Sucrose Fisher Scientific BP220-1
Syringe Filter, 0.45 PVDF MilliporeSigma SLHV033RS
Syringe Filter, 0.8 MCE MilliporeSigma SLAA033SS
Syringe filter, 5 µm PVDF MilliporeSigma SLSV025LS
T150 culture flask Falcon 355001
Tris-HCl MP Biomedicals LLC 816116
Ultrasonic water bath Branson CPX-952-116R
X-gal Corning 46-101-RF

References

  1. Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
  2. Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
  3. Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
  4. Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
  5. Nguyen, H. -. M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
  6. Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
  7. Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
  8. Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
  9. Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
  10. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
  11. Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
  12. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
  13. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
  14. Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
  15. Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
  16. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2014).
  17. Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
  18. Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
  19. Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
  20. Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).
  21. Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
  22. Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
  23. Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
  24. Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
  25. Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
  26. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
  27. Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
  29. Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
  30. Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).

Play Video

Cite This Article
Nguyen, H., Sah, N., Humphrey, M. R. M., Rabkin, S. D., Saha, D. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (171), e62677, doi:10.3791/62677 (2021).

View Video