Test in vitro à haut débit utilisant des organoïdes tumoraux dérivés du patient

Toutes les expériences impliquant des matériaux d’origine humaine ont été réalisées en vertu de la Déclaration d’Helsinki et approuvées à l’avance par le comité d’éthique de l’Université de médecine de Fukushima (numéros d’approbation 1953 et 2192; dates d’approbation 18 mars 2020 et 26 mai 2016, respectivement). Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients qui ont fourni les échantillons cliniques utilisés dans cette étude. 1. Culture des PDO REMARQUE : Les F-AOP forment des amas cellulaires qui présentent une variété de morphologies hétérogènes et se développent en culture en suspension (Figure 1). De plus, les F-PDO peuvent être cultivés pendant plus de 6 mois et peuvent être cryoconservés pour une utilisation future. Décongélation des AOP stockées (jour 0) Décongeler et semer les AOP (p. ex. RLUN007, adénocarcinome pulmonaire) au jour 0(figure 1). Tout d’abord, ajoutez 15 mL de milieu pour les PDO (voir tableau des matériaux)contenant 1 % de supplément de B-27 et 30 ng/mL de facteur de croissance épidermique à un tube de centrifugeuse stérile de 50 mL. Après avoir retiré le flacon congelé du stockage d’azote liquide, agiter doucement les PDO dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 min. Ensuite, retirez le flacon du bain-marie, essuyez le flacon avec 70% d’éthanol, puis déplacez le flacon dans une armoire de sécurité biologique. Transférer le contenu du flacon dans le tube contenant 15 mL de milieu pour les AOP. Mélanger les PDO et le milieu en pipetant doucement de haut en bas cinq fois avec une pipette de transfert de 3 mL. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 3 min à ~25 °C et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille AOP dans 5 mL de milieu frais et transférer dans une fiole de 25 cm2 (voir tableau des matières)avec pipetage doux. Enfin, cultiver les AOP dans un incubateur à 37 °C dans 5% deCO2. Changez le médium deux fois par semaine (jours 3-7). Centrifuger la suspension d’AOP pour précipiter les grappes de cellules et remplacer 4 mL du milieu (80 % du volume). Remettre en suspension les cellules dans le milieu frais.REMARQUE: La majorité des RLUN007 apparaissent sous forme de grappes de cellules de 100 à 500 μm de diamètre. Lorsque la couleur du rouge phénol dans le milieu passe au jaune comme le montre la figure 1A, remplacez le milieu plus fréquemment. Si le milieu jaunit le lendemain du remplacement et que chaque amas de cellules fusionne pour former des amas plus grands de >500 μm de diamètre, passage à un rapport de division de 1:2. Sous-culture (jours 8-28) des PDONOTE: Compte tenu de la difficulté de mesurer réellement le nombre de cellules individuelles, le moment du passage est déterminé en fonction d’une densité de grappes cellulaires appropriée et de la taille de la pastille aopée après centrifugation (Figure 1B). Dans le cas de RLUN007, le volume de la pastille AOP atteint 30 μL (densité saturée en flaconsde 25 cm 2) environ 2 semaines après la décongélation. Pour le transfert d’une fiole de25 cm 2 à deux fiolesde 25 cm 2 (P1), transférer la suspension AOP dans un tube centrifuge et centrifuger à 200 x g pendant 2 min à environ 25 °C. Estimer le volume de la pastille d’AOP et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille aOP à l’aide d’une pipette de 5 mL dans 5 mL de milieu frais. Pipettez doucement de haut en bas cinq fois à basse vitesse. Ensuite, transférer la moitié du volume de la suspension AOP (2,5 mL) dans deux flacons et ajouter 2,5 mL de milieu frais à chaque fiole. Cultiver les cellules à 37 °C dans 5% de CO2. Pour le transfert de deux flacons de 25 cm2 à un ballon de 75 cm2 (P2), transférer la suspension aOP de deux flacons dans deux tubes centrifuges et centrifuger l’AOP à 200 x g pendant 2 min à environ 25 °C. Ensuite, estimer le volume de la pastille aOP et remettre la pastille en suspension dans 2,5 mL de milieu frais (par tube). Par la suite, mélanger la suspension aOP dans un tube avec celle dans l’autre et la transférer dans une fiole de 75 cm2 contenant 10 mL de milieu frais. Cultiver les cellules à 37 °C dans 5% de CO2. Transférer les AOP sous-cultivés de deux flaconsde 25 cm 2 à un flacon de 75 cm2 environ 1 semaine après le premier passage(Figure 1C). 2. Inhibition de la croissance HTS REMARQUE: L’activité inhibitrice de croissance des agents anticancéreux contre les PDO est évaluée en mesurant la teneur en ATP intracellulaire, comme le montre la figure 2. Cette étape est effectuée à l’aide d’un kit de test de viabilité cellulaire disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux). Le jour 0, cultiver les PDO (p. ex., RLUN007) dans des flacons jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de grappes de cellules soit disponible pour le test. Un jour avant l’ensemencement, transférer la suspension aOP d’une fiole de 75 cm2 dans un tube de 15 mL et centrifuger à 200 x g pendant 2 min pour mesurer le volume de granulés aOP. Ensuite, remettez en suspension la pastille aOP dans 15 mL de milieu frais et transférez-la dans une fiole de 75 cm2. Cultiver les cellules à 37 °C dans 5% de CO2.REMARQUE: Le volume de granulés d’AOP requis dépend du taux de dilution de chaque AOP et du nombre de plaques de 384 puits utilisées pour l’essai. Pour RLUN007, un volume de granulés cellulaires de 200 μL est nécessaire pour l’ensemencement dans dix plaques de 384 puits. Le jour 1 (24 h après le changement du milieu), hachez les AOP à l’aide d’un équipement de fragmentation et de dispersion cellulaire (voir Tableau des matériaux)avec un porte-filtre contenant un filtre maillé de 70 μm. Ensuite, diluer 15 mL de la suspension d’AOP par 10x. Ensemencez 40 μL de la suspension AOP dans des microplaques sphéroïdes (fond rond) à très faible fixation de 384 puits (voir Tableau des matériaux)à l’aide d’un distributeur de suspension cellulaire (voir Tableau des matériaux).REMARQUE: Pour le hachage des grappes de cellules, il est recommandé d’utiliser l’équipement de fragmentation et de dispersion de cellules disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux). 24 h après l’ensemencement (jour 2), traiter les AOP avec 0,04 μL de solutions d’agents d’essai à des concentrations finales comprises entre 20 μM et 1,0 nM (10 dilutions en série) à l’aide d’un manipulateur de liquide (voir tableau des matériaux). Le jour 8 (144 h après le traitement de la substance d’essai), ajouter le réactif de mesure intracellulaire de l’ATP aux puits d’essai. Mélanger les plaques à l’aide d’un mélangeur et incuber pendant 10 min à 25 °C. Mesurer la teneur intracellulaire en ATP sous forme de luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques (voir Tableau des matériaux). Pour calculer la viabilité de la cellule, divisez la quantité d’ATP dans les puits d’essai par celle dans les puits de contrôle contenant le véhicule, en soustrayant le fond. Pour calculer le taux de croissance sur 6 jours, divisez la quantité d’ATP dans les puits de contrôle du véhicule par celle dans les puits de contrôle du véhicule 24 h après l’ensemencement. Calculer la concentration inhibitrice de 50 % (CI50)et l’aire sous la courbe (ASC) à partir des courbes dose-réponse à l’aide d’un logiciel d’analyse des données biologiques (voir tableau des matériaux). Le facteur Z est un paramètre sans dimension qui va de 1 (séparation infinie) à <0, défini comme Z = 1 – (3σc+ + 3σc-) / |μc+ – μc-|, où σc+, σc-, μc+ et μc- sont les écarts-types (σ) et les moyennes (μ) des contrôles élevé (c+) et faible (c−)14, respectivement. 3. HTS avec un système de prélèvement cellulaire et d’imagerie pour l’inhibition de la croissance REMARQUE: S’il y a un écart important (lorsque le coefficient de variation [CV] au test est supérieur à 20%) dans les données utilisant le protocole 2, les PDO d’une taille sélectionnée peuvent être ensemencés dans des plaques de 96 ou 384 puits à l’aide d’un système de prélèvement et d’imagerie cellulaire (Figure 2). Le protocole est le même que celui décrit aux étapes 2.1 et 2.2 de la section précédente. Cette étape est effectuée à l’aide d’un système de prélèvement et d’imagerie de cellules disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux). Le jour 1, réglez une microplaque sphéroïde à très faible attache de 384 puits avec 40 μL de milieu/puits comme plaque de destination sur le système de prélèvement et d’imagerie cellulaire. Remplir la chambre de prélèvement (voir Tableau des matériaux)avec 6 mL de milieu de culture et centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min pour éliminer les bulles d’air. Ajouter les PDO suspendus dans le milieu (volume de granulés AOP, 4 μL) à la chambre de prélèvement et les mettre sur le système. Tenir la chambre pendant au moins 1 minute, suivie d’une dispersion, de sorte que les amas de cellules se déposent au fond de la chambre; ensuite, effectuez un balayage de la chambre. Réglez la taille de prélèvement sur 140-160 μm (surface 15 386-20 000 μm2)sur le système pour la sélection automatique des grappes de cellules. Ensuite, vérifiez la qualité des grappes de cellules sélectionnées sur les images numérisées et transférez dix grappes de cellules par puits à l’aide d’embouts de prélèvement (voir Tableau des matériaux)dans la plaque de destination. Effectuez les étapes du protocole à partir de l’étape 2.3. 4. HTS pour la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps REMARQUE: Cette étape est effectuée à l’aide d’un système disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux),qui est un instrument de mesure d’impédance électrique. Il est utilisé pour évaluer la cytolyse des PDO par cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) avec des anticorps monoclonaux et des cellules tueuses naturelles (NK) (Figure 3). Les cellules NK sont produites à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique à l’aide du kit de production de cellules NK (voir tableau des matériaux),en suivant les instructions du fabricant. Mesure de l’activité ADCC Le jour 0, recouvrir une plaque de 96 puits (voir tableau des matériaux) de50 μL de solution de fibronectine de 10 μg/mL (0,5 μg/puits) à 4 °C pendant la nuit. Le jour 1, après avoir retiré la solution de fibronectine, ajouter 50 μL du milieu de culture à chaque puits pour mesurer l’impédance de fond. Avant l’ensemencement, ajouter 5 mL de réactif de dissociation de culture cellulaire (voir tableau des matériaux)aux AOP (RLUN007 : 100 μL de la pastille aOP dans une fiole de 75 cm2) et incuber dans un incubateur à CO2 à 37 °C pendant 20 min pour disperser les AOP. Pour arrêter la trypsinisation, ajouter 5 mL de milieu, centrifuger et retirer le réactif de dissociation. Rincer les AOP avec un milieu frais et filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 μm (voir Tableau des matériaux). Compter le nombre de cellules à l’aide d’un analyseur de viabilité cellulaire (voir Tableau des matériaux). Transférer la suspension aOP dans un réservoir et mélanger à l’aide d’un pipetteur multicanal. Ajouter la suspension AOP dans des puits à 5 x 104 cellules/puits dans une plaque de 96 puits. Chaque puits contient un volume final de 100 μL. Ensuite, placez la plaque dans une armoire de sécurité biologique à environ 25 °C pendant 30 min. Transférer la plaque à l’instrument dans un incubateur à CO2 à 37 °C. Enregistrez les changements dans les signaux d’impédance toutes les 15 minutes en tant qu’indice de cellule. Décongeler les cellules NK dans un bain-marie à 37 °C le même jour que l’ensemencement de l’AOP. Transférer les cellules du flacon dans un tube de 15 mL contenant 10 mL de milieu pour cellules NK (voir Tableau des matériaux)et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à environ 25 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu frais. Après le comptage des cellules, ajustez la densité cellulaire à 1 x10 6 cellules/mL et transférez-la dans une fiole de 75 cm2. Cultiver les cellules NK dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C. Le jour 2, préparer les solutions d’anticorps (solution saline tamponnée au phosphate) à 10 fois la concentration finale dans des plaques stériles à fond en V de 96 puits. Retirer 60 μL de milieu de chaque puits et ajouter 10 μL de trastuzumab ou de solution de cétuximab (10 μg/mL, 1 μg/mL et 0,1 μg/mL) aux AOP. Transférez les plaques à l’instrument dans un incubateur et enregistrez l’indice cellulaire pendant 1 h. Transférez la suspension de la cellule NK dans un tube de 50 mL et comptez le nombre de cellules. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 min et ajustez la densité des cellules NK à 1 x10 6 cellules/mL et 2 x 106 cellules/mL avec le milieu pour les PDO. Ajouter 50 μL de suspension de cellules NK aux cellules effectrices (NK) à un rapport de cellules cibles (RLUN007) de 1:1 ou 2:1. Les concentrations finales des anticorps sont de 1 μg/mL, 0,1 μg/mL et 0,01 μg/mL. Conservez la plaque à environ 25 °C pendant 15 min et retournez les plaques à l’instrument. Collecte et analyse des données Convertissez l’index cellulaire en pourcentage des valeurs de cytolyse à l’aide d’un logiciel d’analyse(voir Tableau des matériaux ). Le pourcentage de cytolyse fait référence au pourcentage de cellules cibles tuées par les cellules NK par rapport aux cellules cibles (PDO) seules comme témoin. Soustrayez les indices cellulaires des puits contenant uniquement des cellules NK de l’index des puits échantillons à chaque point temporel. Normaliser chaque valeur à l’indice cellulaire immédiatement avant l’ajout d’anticorps. Convertissez l’indice cellulaire normalisé en pourcentage de cytolyse à l’aide de l’équation suivante : % cytolyse = (1 – index cellulaire normalisé [puits d’échantillonnage]) / indice cellulaire normalisé (puits cibles seuls) x 100.