מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום
Summary
העברת אנרגיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת היא שיטה העוקבת אחר הדינמיקה של ה- tRNA במהלך סינתזת חלבונים ריבוזומליים. על ידי מעקב אחר ריבוזומים בודדים, זוהו אוכלוסיות לאהומוגניות, אשר שופכים אור על מנגנונים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לעקוב אחר שינויים קונפורמציה ביולוגית באופן כללי כדי לחשוף קשרי גומלין דינמיים-פונקציה במערכות ביולוגיות מורכבות רבות אחרות. שיטות מולקולה בודדת יכולות לבחון צעדים מגבילים שאינם בקצב ומתווכים מרכזיים מאוכלסים נמוך, שאינם נגישים בשיטות הרכב קונבנציונליות בשל האפקט הממוצע.
Abstract
הריבוזום הוא קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין גדול שמרכיב חלבונים באופן תהליכי לאורך תבניות mRNA. הקוטר של ריבוזום הוא כ 20 ננומטר כדי להכיל מצעים tRNA גדולים באתרי A,P ו- E. כתוצאה מכך, הדינמיקה ריבוזום הם באופן טבעי דה-phased במהירות. שיטת מולקולה אחת יכולה לזהות כל ריבוזום בנפרד ולהבחין באוכלוסיות אינומוגניות, החיוניות כדי לחשוף את המנגנונים המורכבים של מערכות מרובות רכיבים. אנו מדווחים על הפרטים של שיטת smFRET המבוססת על המיקרוסקופ ההפוך של ניקון Ti2 כדי לחקור את הדינמיקה ריבוזום בין חלבון ריבוזומלי L27 ו tRNAs. ה-L27 מסומן בעמדת Cys 53 הייחודית שלו וממוקם מחדש לריבוזום שתוכנן חסר L27. ה- tRNA מסומן באזור המרפק שלו. כאשר ה- tRNA עובר למקומות שונים בתוך הריבוזום במהלך מחזור התארכות, כגון טרום ולאחר טרנסלוקציה, יעילות FRET ודינמיקה מציגות הבדלים, אשר הציעו תת-אוכלוסין מרובים. אוכלוסין משנה אלה אינם ניתנים לזיהוי בשיטות הרכב. מיקרוסקופ smFRET מבוסס TIRF בנוי על מיקרוסקופ הפוך ידני או ממונע, עם תאורת לייזר ביתית. דגימות הריבוזום מטוהרות על ידי אולטרה-צנטריפוגה, נטענות לתא מדגם רב-ערוצי שנבנה בבית ואז מוארות באמצעות שדה לייזר אוונסנטי. נקודת לייזר השתקפות ניתן להשתמש כדי להשיג שליטה משוב של מיקוד מושלם. אותות הפלואורסצנטיות מופרדים על ידי צריח מסנן ממונע ונאספים על ידי שתי מצלמות CMOS דיגיטליות. האינטנסיביות מאוחזרות באמצעות תוכנת NIS-Elements.
Introduction
הריבוזום הוא קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין גדול של 20 ננומטר של מתחם גדול (50S) ותת-unit קטן (30S). הוא מרכיב פפטידים ארוכים לאורך תבנית mRNA בתהליכים ובשיתוף פעולה. ה-30S של ריבוזום נקשר ל-fMet-tRNAfMet ול-mRNA כדי להתחיל בסינתזת חלבונים, וה-50S מצטרף ויוצר את קומפלקס החניכה של 70S. ה- tRNAs מביאים חומצות אמינו לריבוזום באתר A (אתר כריכת אמינואציל- tRNA), בעוד שרשרת הפפטידיל המוארכת מוחזקת באתר P (אתר כריכת פפטידיל- tRNA). בקומפלקס טרום טרנסלוקציה, שרשרת הפפטידיל מועברת ל- tRNA באתר A עם חומצת אמינו אחת נוספת. בינתיים, TRNA אתר P הוא deacylated. לאחר מכן, A-, P-tRNAs לעבור לאתרי P-, E- כדי ליצור את המתחם שלאחר טרנסלוקציה, שבו האתר האלקטרוני מייצג את אתר היציאה tRNA. במצב זה, הפפטידיל-tRNA חוזר לאתר P. מחזור התארכות ממשיך בין טרום ופוסט-קונפורמציות בעוד ריבוזום translocates על mRNA, קודון אחד בכל פעם1. הריבוזום הוא מאוד מתאם של אתרים פונקציונליים שונים כדי להפוך את התהליך הזה יעיל ומדויק, כגון ratcheting בין subunit2, תנודות הכלאה tRNA3, הפעלות GTPase4, L1 גבעול פתיחה-סגירה5,וכו ‘. כתוצאה מכך, ריבוזומים במהירות דה פאזה כי כל מולקולה נעה בקצב שלה. השיטות הקונבנציונליות יכולות רק להסיק פרמטרים ממוצעים לכאורה, אבל מינים מאוכלסים נמוכים או קצרי מועד יהיו מוסווים באפקט הממוצע6. שיטת מולקולה אחת יכולה לשבור מגבלה זו על ידי זיהוי כל ריבוזום בנפרד, ואז לזהות מינים שונים באמצעות שחזור סטטיסטי7. אתרי תיוג שונים יושמו כדי לחקור דינמיקה ריבוזום, כגון האינטראקציות בין tRNA-tRNA8, EF-G-L119, L1-tRNA10,וכו ‘. בנוסף, על ידי תיוג תת-units הגדול והקטן, בהתאמה, קינטיקה בין-תת-יונית ותיאום עם גורמים נצפים11,12. בינתיים, שיטת smFRET יש יישומים רחבים בתהליכים ביולוגיים מרכזיים אחרים, ושיטות FRET מרובות צבעים מתעוררים13.
בעבר פותח זוג FRET ריבוזום רומן14,15. החלבון הריבוסומלי L27 התבטא, טוהר ותויג, ושולב בחזרה לריבוזום. חלבון זה קיים אינטראקציה עם tRNAs במרחק קרוב ועזר לייצב את ה- TRNA של אתר P בקומפלקס שלאחר הטרנסלוקציה. כאשר tRNA עבר מאתר A לאתר P, המרחק בין חלבון זה לבין tRNA מתקצר, אשר ניתן להבחין על ידי אות smFRET. מספר אוכלוסיות ריבוזום זוהו בשיטות סטטיסטיות ומוטאגנזה, וחילופין ספונטני של אוכלוסיות אלה במתחם הטרנסלוקציה שלפני אך לא לאחר הטרנסלוקציה מרמז על כך שהריבוזום גמיש יותר לפני שהוא עובר על ה- mRNA, ונוקשה יותר במהלךפענוח 16,17,18. וריאציות אלה חיוניות לתפקוד ריבוזום. כאן, הפרוטוקול מתאר את הפרטים של תיוג ריבוזום / tRNA, שילובם ריבוזום, הכנת מדגם smFRET, ורכישת נתונים / ניתוח19.
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET רגיש לאותות רקע. ראשית, יש צורך לצפות את תא המדגם עם 0.05% tween ולאחר מכן להתווסף במקביל עם פתרון ריבוזום לחסום כריכה לא ספציפית של ריבוזום אל פני השטח. כדי לראות פלואורסצנטיות מפליטת Cy5 המקבלת, קוקטייל נבלות החמצן (פתרונות דאוקסי, גלוקוז ותרולוקס) הוא חיוני. ללא פתרון זה, ההלבנה מהירה מדי בע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה”ב (R01GM111452) וקרן וולש (E-1721).
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. 生物化学. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin’s inhibition mechanism on ribosome translocation. 生物化学. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency “-1” and “-2” Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
