Эффективный метод направленной индукции гепатоцитоподобных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека
Summary
В этой рукописи описывается подробный протокол дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) в функциональные гепатоцитоподобные клетки (HLC) путем непрерывного дополнения Activin A и CHIR99021 во время дифференцировки hESC в окончательную эндодерму (DE).
Abstract
Потенциальные функции гепатоцитоподобных клеток (ГЛК), полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs), имеют большие перспективы для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Здесь приведен эффективный и воспроизводимый метод дифференциации гЭСК на функциональные КВУ. Создание линии эндодермы является ключевым шагом в дифференциации к КВУ. С помощью нашего метода мы регулировали ключевые сигнальные пути, непрерывно дополняя активин А и CHIR99021 во время дифференцировки hESC в окончательную эндодерму (DE), за которой следует генерация печеночных клеток-прогениторов и, наконец, HLC с типичной морфологией гепатоцитов поэтапным методом с полностью определенными реагентами. Полученные из hESC HLC, полученные этим методом, экспрессируют специфические для стадии маркеры (включая альбумин, ядерный рецептор HNF4α и котранспортный полипептид таурохолата натрия (NTCP)) и демонстрируют особые характеристики, связанные со зрелыми и функциональными гепатоцитами (включая зеленое окрашивание индоцианином, хранение гликогена, окрашивание гематоксилин-эозина и активность CYP3), и могут обеспечить платформу для разработки приложений на основе HLC в изучении заболеваний печени.
Introduction
Печень является высоко метаболическим органом, который играет несколько ролей, включая раскисление, хранение гликогена, а также секрецию и синтез белков1. Различные возбудители, лекарственные препараты и наследственность могут вызывать патологические изменения в печени и влиять на ее функции2,3. Гепатоциты, как основная функциональная единица печени, играют важную роль в искусственных системах поддержки печени и устранении лекарственной токсичности. Однако ресурс первичных гепатоцитов человека ограничен в клеточной терапии, а также в исследованиях заболеваний печени. Поэтому разработка новых источников функциональных гепатоцитов человека является важным направлением исследований в области регенеративной медицины. С 1998 года, когда были установлены4hESCs, hESCs широко рассматривались исследователями из-за их превосходного дифференцировального потенциала (они могут дифференцироваться в различные ткани в подходящей среде) и высокой степени самовозобновляемости, и, таким образом, обеспечивают идеальные исходные клетки для биоискусственной печени, трансплантации гепатоцитов и даже тканевой инженерии печени5.
В настоящее время эффективность дифференцировки печенки может быть значительно увеличена за счет обогащения энтодермы6. При линейной дифференцировке стволовых клеток в эндодерму ключевыми факторами в узле стадии формирования эндодермы являются уровни трансформировки фактора роста β (TGF-β) и сигнальных путей WNT. Активация высокого уровня TGF-β и сигнализации WNT может способствовать развитию эндодермы7,8. Активин А является цитокином, принадлежащим к надсемейству TGF-β. Поэтому Активин А широко используется в индукции эндодермы индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) и hESCs9,10. GSK3 представляет собой серин-треонин протеинкиназу. Исследователи обнаружили, что CHIR99021, специфический ингибитор GSK3β, может стимулировать типичные сигналы WNT и может способствовать дифференцировке стволовых клеток при определенных условиях, предполагая, что CHIR99021 имеет потенциал для индуцирования дифференцировки стволовых клеток в эндодерму 11,12,13.
Здесь мы сообщаем об эффективном и воспроизводимом методе эффективного индуцирования дифференциации hESCs в функциональные HLC. Последовательное добавление активина А и CHIR99021 произвело около 89,7±0,8% SOX17 (DE маркер)-положительных клеток. После дальнейшего созревания in vitroэти клетки экспрессировали печеночные специфические маркеры и проявляли гепатоцитарно-подобную морфологию (основанную на окрашивание гематоксилин-эозином (H & E)) и функции, такие как поглощение индоцианинового зеленого (ICG), хранение гликогена и активность CYP3. Результаты показывают, что hESCs могут быть успешно дифференцированы в зрелые функциональные HLC с помощью этого метода и могут обеспечить основу для исследований, связанных с заболеваниями печени, и скрининга лекарств in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем пошаговый метод, который индуцирует HLC из hESCs в три этапа. На первом этапе Activin A и CHIR99021 использовались для дифференциации hESCs в DE. На втором этапе KO-DMEM и DMSO использовали для дифференцировки DE в печеночные клетки-прогениторы. На третьем этапе HZM плюс HGF, OSM и гидрокортиз?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 81870432 и 81570567 X.L.Z.), (No 81571994 P.N.S.); Фонд естественных наук провинции Гуандун, Китай (No 2020A1515010054 для P.N.S.), Фонд Университета Ли Ка Шин Шаньтоу (No. L1111 2008 в P.N.S.). Мы хотели бы поблагодарить профессора Стэнли Лина из Медицинского колледжа Университета Шаньтоу за полезные советы.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti – Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti – Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti – α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
References
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity. Archives of Toxicology. , (2021).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. 发育生物学. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
