ヒト胚性幹細胞からの肝細胞様細胞誘導の効率的な方法
Summary
本稿では、ヒト胚性幹細胞(hESC)を、hESC分化中にアクチビンAおよびCHIR99021を確実なエンドドーム(DE)に継続的に補い、機能性肝細胞様細胞(HLC)に分化するための詳細なプロトコルを記述する。
Abstract
ヒト胚性幹細胞(hESC)由来の肝細胞様細胞(HLC)の潜在的な機能は、疾患のモデル化および薬物スクリーニング用途に大きな約束を果たしています。ここでは、機能性 Hfc に hESC を分化するための効率的で再現可能な方法を提供します。内胚葉系統の確立は、HLFc との差別化の重要なステップです。我々の方法により、hESC分化中のアクチビンAおよびCHIR99021を確実な内因(DE)に連続的に補い、続いて肝前駆細胞の生成、そして最後に完全に定義された試薬を用いた段階的な方法で典型的な肝細胞形態を有するHLCを補うことによって、主要なシグナル伝達経路を調節する。この方法によって生成されるhESC由来のHFCは、ステージ固有のマーカー(アルブミンを含む) HNF4α核受容体、及びタウロコール酸共輸送ポリペプチド(NTCP)と、成熟および機能的肝細胞(中毒性の緑染色、グリコーゲン保存、ヘマトキシリン-エオシン染色およびCYP3活性を含む)に関する特別な特徴を示し、肝疾患の研究におけるHLCベースの応用の開発のためのプラットフォームを提供することができる。
Introduction
肝臓は、脱酸化、グリコーゲンの貯蔵、タンパク質の分泌と合成など、いくつかの役割を果たす高度に代謝性の高い器官である1。様々な病原体、薬物および遺伝は肝臓の病理学的変化を引き起こし、その機能に影響を及ぼす2,3.肝細胞は、肝臓の主要な機能単位として、人工肝支援システムおよび薬物毒性除去において重要な役割を果たす。しかし、原発性ヒト肝細胞の資源は、細胞ベースの治療だけでなく、肝臓病の研究において限られている。したがって、ヒト肝細胞の機能性を新たに開発することは、再生医療分野における重要な研究の方向性である。hESCが確立された1998年から、hESCは優れた分化能力(適切な環境で様々な組織に分化することができる)と高度な自己更新性のために研究者によって広く検討され、バイオ人工肝、肝細胞移植、さらには肝組織工学5に理想的なソース細胞を提供する。
現在、肝分化効率は、内胚葉6を充実させることにより大きく高めることができる。幹細胞の内胚葉への系統分化において、変容成長因子β(TGF-β)シグナル伝達およびWNTシグナル伝達経路のレベルは、内胚形成段階のノードにおける重要な因子である。高レベルのTGF-βおよびWNTシグナル伝達の活性化は、endoderm7,8の開発を促進することができる。アクチビンAは、TGF βスーパーファミリーに属するサイトカインである。従って、アクチビンAは、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)及びhESC9,10の内胚葉誘導に広く用いられている。GSK3はセリンスレオンニンプロテインキナーゼです。研究者は、GSK3βの特定の阻害剤であるCHIR99021が典型的なWNTシグナルを刺激し、特定の条件下で幹細胞分化を促進できることを発見し、CHIR99021がエンドドーム11、12、13に幹細胞分化を誘導する可能性があることを示唆している。
ここでは、hESCの機能的なHCへの分化を効果的に誘導するための効率的で再現可能な方法を報告します。アクチビンAおよびCHIR99021の順次添加により、約89.7±0.8%SOX17(DEマーカー)陽性細胞が産生された。さらに 体質化された細胞は、肝特異的マーカーを発現し、肝細胞様形態(ヘマトキシリン-エオシン染色(H&E)に基づく)およびインドシアニングリーン(ICG)の取り込み、グリコーゲン貯蔵およびCYP3活性の取り込みなどの機能を発揮した。この結果は、hESCがこの方法によって成熟した機能的なHlCに正常に分化され、肝疾患関連の研究と インビトロ 薬物スクリーニングの基礎を提供できることを示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、hESCからHCSを誘導するステップワイズ方式を3段階で提示する。第1段階では、アクティビンAとCHIR99021を使用して、hESCをDEに区別しました。第2段階では、KO-DMEMおよびDMSOを用いて、DEを肝前駆細胞に分化した。第3段階では、HZMプラスHGF、OSMおよびヒドロコルチゾン21-半ミコミネートナトリウム塩を使用して、肝前駆細胞をHLCsに分化し続けた。
プロトコルを使用す…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団(81870432第1、X.L.Z.への81570567)(81571994からP.N.S.)によって支えられました。中国広東省自然科学財団(2020A1515010054からP.N.S.)、李嘉誠大学財団(No.L1111 2008からP.N.S.へ。シャントゥ大学医科大学のスタンリー・リン教授に有益なアドバイスをいただき、ありがとうございました。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti – Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti – Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti – α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
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