Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

Die Fähigkeit, in vivo Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie im Kortex von Mäusen durchzuführen, ist von größter Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Signalgebung und Struktur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, der Krankheitspathologie 10,11 und der zellulären Entwicklung ^12,13 . Mit der Implantation chronischer Schädelfenster ist eine Längsschnittbildgebung möglich, die eine wiederholte Bildgebung von kortikalen Arealen für Tage, Wochen oder Monate^13,14 bei lebenden Tieren ermöglicht. Die Multiphotonenmikroskopie ist ideal für die wiederholte In-vivo-Bildgebung aufgrund der verbesserten Tiefensondierung und der reduzierten Lichtschäden im Zusammenhang mit dem verwendeten Infrarotlaser. Dies ermöglicht die Untersuchung der molekularen und zellulären Dynamik bestimmter Zellen in verschiedenen kortikalen Regionen.

Die Multiphotonenmikroskopie wurde für die In-vivo-Bildgebung von neuronalen und Gliazellen in Mäusen 15,16,17,18,19,20 verwendet. Verschiedene Strategien können implementiert werden, um bestimmte Zelltypen und Interessengebiete zu kennzeichnen. Ein gängiger Ansatz besteht darin, die Expression genetisch kodierter fluoreszierender Proteine auf zellspezifische Weise mit dem Cre-Lox-Rekombinationssystem voranzutreiben. Dies kann mit gentechnisch veränderten Mäusen durchgeführt werden, z. B. durch Kreuzung der “floxierten” Maus (Ai14) mit einer Maus, die die Cre-Rekombinase unter einem Promotor von Interesse^{exprimiert 21}. Alternativ kann eine zell- und standortspezifische Markierung mit viralen Injektionen erreicht werden. Hier werden ein Virus, das für die Cre-Rekombinase unter einem zellspezifischen Promotor kodiert, und ein Virus, das für ein floxiertes Gen von Interesse kodiert, in eine definierte Region injiziert. Geeignete Zelltypen, die beide viralen Vektoren erhalten, exprimieren dann die gewünschten Gene. Diese Gene können strukturelle Marker wie tdTomato sein, um Veränderungen in der Zellmorphologie 22 zu sehen, oder genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs), wie GCaMP und / oder^RCaMP, um die Kalziumdynamik²³ zu untersuchen. Methoden der genetischen Rekombination können einzeln oder in Kombination angewendet werden, um einen oder mehrere Zelltypen zu markieren. Ein dritter Ansatz, der keine transgenen Mäuse oder viralen Konstrukte (die eine begrenzte Verpackungskapazität haben) erfordert, ist die In-utero-Elektroporation von DNA-Konstrukten²⁴. Abhängig vom Zeitpunkt der Elektroporation können verschiedene Zelltypen anvisiert werden^25,26,27.

Bei der Durchführung von Multiphotonen-Bildgebung können Mäuse im Wachzustand oder in Narkose abgebildet werden. Die Bildgebung von wachen Mäusen kann durchgeführt werden, indem die Maus über eine angebrachte Kopfplatte²⁸ gesichert wird. Dieser Ansatz wird weniger stressig, indem eine relativ freie Bewegung des Tieres mit Methoden wie freischwebenden, luftgestützten Styroporkugeln²⁹, frei schwebenden Laufbändern¹ oder einem luftgestützten Heimkäfigsystem ermöglicht wird, bei dem Mäuse durch eine angebrachte Kopfplatte befestigt werden und sich in einer offenen Kammer³⁰ bewegen dürfen. Für jede dieser Bildgebungsbedingungen ist es zunächst notwendig, die Mäuse an den Bildgebungsaufbau zu gewöhnen. Dieses Papier beschreibt das Gewöhnungs- und Bildgebungsverfahren unter Verwendung eines luftgestützten Heimkäfigsystems.

Dieses Protokoll beschreibt die Implantation eines chronischen Schädelfensters für die longitudinale In-vivo-Bildgebung im Kortex. Hier werden wir Mäuse verwenden, die GCaMP6f in Astrozyten bedingt exprimieren, um die Dynamik der Kalziumsignalisierung zu überwachen. Darüber hinaus beschreibt dieses Papier das Verfahren für virale Injektionen mit tdTomato als Label für Neuronen. Dies ermöglicht die Bestimmung von Veränderungen der neuronalen synaptischen Struktur und/oder der Verfügbarkeit als Strukturmarker, der eine wiederholte Bildgebung desselben Astrozyten ermöglicht. Während des gesamten Protokolls werden entscheidende Schritte hervorgehoben, um die bestmögliche Qualität der Bilder aus der Multiphotonenmikroskopie zu gewährleisten.