Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation
Summary
Bu makale, sakkaroz yoğunluğu gradyan ultracentrifugation kullanarak memeli hücrelerinden geri dönüşüm endozomlarının hazırlanması için bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.
Abstract
Endosomal kaçakçılık, çok çeşitli biyolojik olayları düzenleyen önemli bir hücresel süreçtir. Proteinler plazma zarından içselleştirilir ve daha sonra erken endozomlara taşınır. İçselleştirilmiş proteinler bozulma için lizozomlara iletilebilir veya plazma zarı geri dönüştürülebilir. Membran malzemelerinin endositozdan uzaklaştırılmasını dengelemek için sağlam bir endositotik geri dönüşüm yolu gereklidir. ADP-ribosilasyon faktörü 6 (ARF6) dahil olmak üzere çeşitli proteinlerin yolu düzenlediği bildirilmektedir. Yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme hücre fraksiyonasyonu için klasik bir yöntemdir. Santrifüjlemeden sonra organeller izopik yüzeylerine çökeltilir. Kesirler toplanır ve diğer aşağı akış uygulamaları için kullanılır. Burada, yoğunluk gradyan ultrasantrifüjasyonunu kullanarak transfected memeli hücrelerinden geri dönüşüm endozom içeren bir fraksiyon elde etmek için bir protokol açıklanmıştır. İzole fraksiyonlar, protein içeriklerini analiz etmek için standart Batı şişkinliğine maruz kaldı. Bu yöntemi kullanarak, Ras ile ilişkili bir C3 botulinum toksin substratı 1 (Rac1) guanin nükleotid değişim faktörü olan yutkunma ve hücre hareketliliği 1 ‘in (ELMO1) plazma zarının hedeflenmesinde ARF6 aracılı endosit geri dönüşümünden geçtiğini belirledik.
Introduction
Endosomal kaçakçılık, çeşitli biyolojik olayları bulaştıran temel bir fizyolojik süreçtir1, örneğin, sinyal reseptörlerinin, iyon kanallarının ve yapışma moleküllerinin taşınması. Plazma membranda lokalize proteinler endositoz ile içselleştirilir2. İçselleştirilmiş proteinler daha sonra erken endozom3ile sıralanır. Bazı proteinler bozulma için lizozomlara yöneliktir4. Bununla birlikte, hızlı geri dönüşüm ve yavaş geri dönüşüm işlemleri ile önemli miktarda protein hücre yüzeyine geri dönüştürülmektedir. Hızlı geri dönüşümde proteinler erken endozomları bırakır ve doğrudan plazma zarlarına geri döner. Tersine, yavaş geri dönüşümde proteinler önce endosit geri dönüşüm bölmesine sıralanır ve daha sonra plazma zarı ile geri taşınır. Clathrin, retromer kompleksi, retriever kompleksi ve Wiskott-Aldrich sendromu proteini ve SCAR Homologue (WASH) kompleksi gibi çeşitli kargo proteinleri, bu tür membran geri dönüşümsüreçlerine katılır 4,5,6,7 ,8,9. Endositoz ve geri dönüşüm olayının dengesi hücre sağkalımı için çok önemlidir ve çeşitli hücresel olaylara katkıda bulunur10, örneğin, hücre yapıştırma, hücre göçü, hücre polaritesi ve sinyal transdüksiyon.
Küçük bir GTPase olan ARF6, endosit kaçakçılığı7, 11,12‘nin bildirilen bir düzenleyicisi. İlgi çekici olan, çeşitli araştırma grupları ARF6’nın endosit geri dönüşümünde önemini göstermiş13,14,15,16,17. Çalışma, ARF6 aracılı neurit büyümesi ve endosit geri dönüşümü arasındaki ilişkiyi araştırmayı amaçlamaktadır. Önceki rapor, ARF6’nın aktivasyonunun, sitokinoz 1 (DOCK180) kompleksi 18’in ELMO1-ayırıcısına göre hareketederekRac1 etkinliğine kadar olduğunu göstermektedir. Ancak ARF6’nın ELMO1-DOCK180 aracılı Rac1 sinyalini nasıl tetiklediği belirsizliğini koruyor. Arf6 aracılı endosit geri dönüşümün bu süreçteki rolünü araştırmak için yoğunluk gradyan ultracentrifugation kullanıldı. Bunu kullanarak, geri dönüşüm endozom içeren fraksiyon hücre lizatları19elde edildi. Fraksiyon protein içeriği analizi için Batı şişkinliğine maruz kaldı. İmmünoblot sonuçları, beyin bakımından zenginleştirilmiş bir adaptör proteini olan FE65’in varlığı altında, aktif ARF6’nın geri dönüşüm endozom içeren fraksiyonda ELMO1 seviyesini önemli ölçüde artırdığını ortaya koydu. Aşağıdaki protokol, (1) memeli hücrelerinin transfecting prosedürlerini içerir; (2) örneklerin ve yoğunluk degrade sütunlarının hazırlanması; ve (3) geri dönüşüm endozom içeren fraksiyonu elde etmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki protokol, kültürlü hücrelerden geri dönüşüm endozomlarını ultracentrifugation ile izole etme prosedürlerini özetlemektedir. Bu yöntemin güvenilirliği en son yayınla gösterilmiştir 22 Geri dönüşüm endozomlarının Golgi aparatı ve mitokondri gibi diğer organellerdenbaşarıylaizole edildiğini kanıtlayan22. İyi bir ayrılık sonucu elde etmek için bazı kritik adımlara dikkat edilmesi gerekir. Sakkaroz çözeltileri hazırlanırk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Araştırma Hibeleri Konseyi Hong Kong, CUHK doğrudan hibe programı, United College bağış fonu ve TUYF Hayır Kurumu’ndan fonlarla desteklendi. Bu çalışmadaki rakamlar, Ekim 2020’de FASEB Dergisi’nde yayınlanan “ARF6-Rac1 sinyal aracılı neurit büyümesi, nöronal adaptör FE65 tarafından ARF6 ve ELMO1’i düzenleyerek güçlenmiştir” adlı önceki yayınımızdan uyarlanmıştır.
Materials
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
References
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
- Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome – sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
- Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
- Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
- Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
- McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
- O’Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
- D’Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), 1175-1178 (1995).
- Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D’Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
- Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
- Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. 癌症研究. 79 (17), 4426-4438 (2019).
- Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
- Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
- Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
- Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
- Wibo, M., Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. , 1-17 (1976).
- Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
- Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
- Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
- Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
- Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
- Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
- Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
- Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
- Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
- Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. . Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , (2001).
- Rickwood, D., Graham, J. . Centrifugation Techniques. , (2015).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
- Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), 1227-1241 (2011).
