Ultracentrifugation à gradient de densité pour l’étude du recyclage endocytaire dans les cellules de mammifères
Summary
Cet article vise à présenter un protocole de préparation d’endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose.
Abstract
Le trafic endosomal est un processus cellulaire essentiel qui régule un large éventail d’événements biologiques. Les protéines sont internalisées à partir de la membrane plasmique, puis transportées vers les premiers endosomes. Les protéines internalisées pourraient être transitées vers le lysosome pour être dégradées ou recyclées vers la membrane plasmique. Une voie de recyclage endocytaire robuste est nécessaire pour équilibrer l’élimination des matériaux membranaires de l’endocytose. Diverses protéines régulent la voie, y compris le facteur ADP-ribosylation 6 (ARF6). L’ultracentrifugation par gradient de densité est une méthode classique de fractionnement cellulaire. Après la centrifugation, les organites sont sédimentés à leur surface isopycnique. Les fractions sont collectées et utilisées pour d’autres applications en aval. Décrit ici est un protocole pour obtenir une fraction contenant des endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères transfectées en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité. Les fractions isolées ont été soumises à un transfert Western standard pour analyser leur teneur en protéines. En utilisant cette méthode, nous avons identifié que le ciblage de la membrane plasmique de l’engloutissement et de la motilité cellulaire 1 (ELMO1), un facteur d’échange de nucléotides de guanine substrat 1 de la toxine botulique C3 (Rac1) lié à Ras, se fait par recyclage endocytaire médié par ARF6.
Introduction
Le trafic endosomal est un processus physiologique essentiel qui implique divers événements biologiques1,par exemple, le transport des récepteurs de signalisation, des canaux ioniques et des molécules d’adhésion. Les protéines localisées au niveau de la membrane plasmique sont internalisées par endocytose2. Les protéines internalisées sont ensuite triées par l’endosomeprécoce 3. Certaines des protéines sont ciblées sur les lysosomes pour la dégradation4. Cependant, une quantité importante de protéines est recyclée à la surface de la cellule par des processus de recyclage rapides et lents. Lors d’un recyclage rapide, les protéines quittent les premiers endosomes et retournent directement à la membrane plasmique. Inversement, en cas de recyclage lent, les protéines sont d’abord triées dans le compartiment de recyclage endocytaire, puis transportées vers la membrane plasmique. Diverses protéines de cargaison, par exemple la clathrine, le complexe rétromère, le complexe retriever et la protéine du syndrome de Wiskott-Aldrich, et le complexe SCAR Homologue (WASH), participent à de tels processus de recyclage membranaire4,5,6,7,8,9. L’équilibre de l’endocytose et de l’événement de recyclage est crucial pour la survie cellulaire et contribue à divers événements cellulaires10, par exemple, l’adhésion cellulaire, la migration cellulaire, la polarité cellulaire et la transduction du signal.
ARF6, une petite GTPase, est un régulateur signalé du trafic endocytaire7,11,12. Fait intéressant, divers groupes de recherche ont illustré l’importance de l’ARF6 dans le recyclage endocytaire13,14,15,16,17. L’étude vise à étudier la relation entre l’excroissance de neurites médiée par ARF6 et le recyclage endocytaire. Le rapport précédent suggère que l’activation d’ARF6 se fait en amont de l’activité rac1 en agissant sur ELMO1-dédicace du complexe de cytocinèse 1 (DOCK180)18. Cependant, la façon dont ARF6 déclenche la signalisation Rac1 médiée par ELMO1-DOCK180 reste incertaine. L’ultracentrifugation par gradient de densité a été utilisée pour étudier le rôle du recyclage endocytaire médié par ARF6 dans un tel processus. En utilisant cela, la fraction contenant des endosomes de recyclage a été obtenue à partir de lysats cellulaires19. La fraction a été soumise à un transfert western pour l’analyse de la teneur en protéines. Les résultats de l’immunoblot ont révélé que sous la présence de FE65, une protéine adaptatrice enrichie en cerveau, l’ARF6 actif augmentait considérablement le niveau d’ELMO1 dans la fraction contenant des endosomes de recyclage. Le protocole suivant comprend les procédures pour (1) transfecter les cellules de mammifères; 2° la préparation des échantillons et des colonnes de gradient de densité; et (3) l’obtention de la fraction contenant des endosomes de recyclage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole ci-dessus décrit les procédures d’isolement des endosomes de recyclage des cellules cultivées par ultracentrifugation. La fiabilité de cette méthode a été démontrée par la dernière publication22, prouvant que les endosomes de recyclage sont isolés avec succès d’autres organites(Figure 1),tels que l’appareil de Golgi et les mitochondries. Certaines étapes critiques doivent être prises en compte pour obtenir un bon résultat de séparati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds du Research Grants Council Hong Kong, du programme de subventions directes CUHK, du fonds de dotation United College et du TUYF Charitable Trust. Les chiffres de ce travail ont été adaptés de notre publication précédente, « ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentialiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1 » publié dans le FASEB Journal en octobre 2020.
Materials
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
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