فحص الكروموسومات للأجنة البشرية قبل الزرع باستخدام وسط الثقافة المستهلكة: جمع العينات وتحليل الصيغة الصبغية الكروموسومية
Summary
تشير هذه الدراسة إلى بروتوكول لفحص الكروموسومات للأجنة البشرية يستخدم وسط مزرعة مستهلك ، والذي يتجنب خزعة الجنين ويتيح تحديد الصيغة الصبغية للكروموسوم باستخدام NGS. تقدم هذه المقالة الإجراء التفصيلي ، بما في ذلك إعداد وسط الثقافة ، وتضخيم الجينوم الكامل (WGA) ، وإعداد مكتبة تسلسل الجيل التالي (NGS) ، وتحليل البيانات.
Abstract
في الإخصاب السريري في المختبر (IVF) ، تتطلب الطريقة السائدة ل PGT-A خزعة من عدد قليل من الخلايا من الأديم الظاهر (TE). هذه هي السلالة التي تشكل المشيمة. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة مهارات متخصصة ، وهي غازية ، وتعاني من إيجابيات وسلبيات كاذبة لأن أعداد الكروموسومات في TE وكتلة الخلية الداخلية (ICM) ، التي تتطور إلى الجنين ، ليست هي نفسها دائما. وقد توفر تقنية NICS، وهي تقنية تتطلب تسلسل الحمض النووي الذي يتم إطلاقه في وسط الاستزراع من كل من TE و ICM، مخرجا لهذه المشاكل ولكن ثبت سابقا أن فعاليتها محدودة. وتبلغ هذه الدراسة عن البروتوكول الكامل لنظام NICS، الذي يتضمن أساليب أخذ العينات بوسط الاستزراع، وتضخيم الجينوم الكامل وإعداد المكتبة، وتحليل بيانات NGS بواسطة برامجيات التحليل. بالنظر إلى أوقات الحفظ بالتبريد المختلفة في مختبرات الأجنة المختلفة ، لدى علماء الأجنة طريقتان لجمع وسط زراعة الأجنة الذي يمكن اختياره وفقا للظروف الفعلية لمختبر التلقيح الاصطناعي.
Introduction
تم استخدام تقنيات الإنجاب المساعدة (ARTs) بشكل متزايد لعلاج العقم. ومع ذلك، فإن معدل نجاح العلاج المضاد للفيروسات القهقرية، مثل التلقيح الاصطناعي، كان محدودا، ومعدل فقدان الحمل أعلى بكثير من معدل فقدان الحمل لدى السكانالعاديين 1. السبب الرئيسي لهذه المشاكل هو تشوهات الكروموسومات ، والتي توجد عادة في الأجنة البشرية قبل الزرع2. PGT-A هي طريقة فعالة لفحص الأجنة لتوازن الكروموسومات قبل الزرع 3,4. أثبتت بعض الدراسات أن PGT-A يمكن أن يقلل من معدل الإجهاض ويحسن معدل الحمل5،6،7،8. ومع ذلك ، يتطلب PGT-A خبرة فنية معقدة تتطلب تدريبا وخبرة محددة. يمكن أن يتسبب إجراء خزعة الجنين الغازية أيضا في تلف الأجنة9. أظهرت الدراسات أن خزعة البلاستومير يمكن أن تعيق التطور اللاحق ، وقد يؤثر عدد TEs المأخوذة على معدلات الزرع10. على الرغم من أن قضية السلامة الأحيائية طويلة الأجل لخزعة الجنين لم يتم تقييمها بدقة في البشر ، فقد أظهرت الدراسات التي أجريت على الحيوانات آثارها السلبية على تطور الجنين11،12،13.
أشارت التقارير السابقة إلى أنه تم إفراز كميات ضئيلة من مواد الحمض النووي في وسط المزرعة أثناء نمو الجنين ، وقد بذلت جهود لإجراء فحص شامل للكروموسومات (CCS) باستخدام وسط زراعة الأجنة المستهلك14،15،16،17،18. ومع ذلك ، فإن معدلات الكشف ودقة الاختبارات لم تستوف متطلبات الاستخدام السريري المكثف. وأبلغت هذه الدراسة عن تحسن في اختبار النظام الوطني للإحصاء من أجل زيادة معدلات الكشف فضلا عن دقة اختبار النظام الوطنيللإحصاء 19. في السنوات الأخيرة ، تمت دراسة سائل القيلة الأريمية (BF) كعينة تحليلية من PGT-A طفيف التوغل. ومع ذلك ، فإن نسبة التضخيم الناجح على مستوى الجينوم والحمض النووي القابل للكشف في عينات سائل الكيسة الأريمية تتراوح من 34.8٪ إلى 82٪ 20،21،22. يتراوح حجم BF المبلغ عنه في دراسات مختلفة من 0.3 nL إلى 1 μL. نظرا لانخفاض كمية الحمض النووي في BF ، من الممكن زيادة كمية الحمض النووي الخالي من الخلايا عن طريق خلط سائل الكيسة الأريمية ووسط الثقافة لتحسين معدل نجاح واتساق الكشف. كوزنيتسوف وآخرون.23 و Li et al.24 عالجوا المنطقة الشفافة بالليزر وألقوا سائل الكيسة الأريمية في وسط الاستزراع لتحسين الكمية الإجمالية للحمض النووي الجنيني ، وكان معدل تضخيم عينات الوسط / BF مجتمعة بعد WGA 100٪ و 97.5٪ على التوالي. حصل Jiao et al.25 أيضا على معدل نجاح تضخيم بنسبة 100٪ باستخدام نفس الطريقة.
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا يتضمن إعداد عينات الوسائط المستهلكة وإعداد NGS وتحليل البيانات. عن طريق إزالة الخلايا الركامية بعناية من البويضات ، أجرت الدراسة الحالية حقن الحيوانات المنوية المفردة داخل الهيولى (ICSI) ومزرعة الكيسة الأريمية. تم جمع الوسيط المستغرق في اليوم 4 أيام 5 / يوم 6 لإعداد مكتبة WGA و NGS. وباستخدام تكنولوجيا NICS، بسطت الدراسة الحالية خطوات إعداد مكتبة WGA و NGS في حوالي 3 ساعات وحصلت على نتائج CCS بشكل غير جراحي في حوالي 9 ساعات.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
إذا كانت نتائج NICS ملوثة بالمواد الوراثية الأبوية ، فتأكد من إزالة جميع خلايا الركام – كورونا الشعاعي وتأكد من إجراء الحقن المجهري للتخصيب. يتم تجنب التخزين المتوسط غير السليم أو عمليات إعداد القالب ، مما قد يؤدي إلى تدهور الحمض …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا Shiping Bo و Shujie Ma على مساعدتهم في تحليل بيانات NGS. التمويل: تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي (رقم المنحة 2018YFC1003100).
Materials
| 1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended. |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | This can be replaced by other brand/For sample transfer |
| 100 % ethanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | This can be replaced by other brand/For DNA library purification |
| Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile | BD Bioscience | 363037 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile | BD Bioscience | 353001 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile | BD Bioscience | 353002 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Cell Lysis Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| Cell Lysis Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| ChromGo software | Yikon Genomics | Data analysis | |
| CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library purification |
| Cryotop open systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Distill water | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | To dissolve DNA |
| ES (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Hyaluronidase solution, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Illumina MiSeq® System | Illumina | SY-410-1001 | For library sequencing |
| Incubator | Labotect | Inkubator C16 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Library buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Library Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Magnetic Stand | DynaMagTM-2 | 12321D | For library purification |
| Microscope | OLYMPUS | 1X71 | This can be replaced by other brand/For embryo observation |
| Mini-centrifuge | ESSENSCIEN | ELF6 | For separation |
| MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| NICSInst library preparation kit | Yikon Genomics | KT1000800324 | Whole genome amplification and library construction |
| NICSInst Sample Prep Station | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificate DNA |
| Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture |
| Pasteur Pipette | Oirgio | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For embryo tansfer |
| Pasteur pipettes | ORIGIO | PP-9-1000 | This can be replaced by other brand/For IVF laboratory |
| Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Qubit® 3.0 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | For library quantification |
| Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | For embryo blastocyst stage culture |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture |
| Quinn's Advantage Fertilization Medium | SAGE | ART-1020 | This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES | SAGE | ART-1023 | This can be replaced by other brand/For embryo clutrure |
| Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit | SAGE | ART-3010 | This can be replaced by other brand/To denude the oocyte |
| Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil | SAGE | ART-4008P | This can be replaced by other brand/To cover the culture medium |
| STRIPPER TIPS | ORIGIO | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells |
| Vitrification Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vitrification kit | KITAZATO BioPharma | VT101 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Sample mix |
| VS (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| ZILOS-tk Laser System | Hamilton Thorne | CLASS 1 laser | This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse |
References
- Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
- Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
- Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
- Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
- Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
- Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
- Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
- Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24 (2012).
- Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
- Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117 (2013).
- Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
- Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
- Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
- Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
- Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
- Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. 医学. 94 (12), e669 (2015).
- Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
- Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
- Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid?. Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
- Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262 (2018).
- Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275 (2018).
- Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
- Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter’s syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
- Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
- . Qubit dsDNA HS Assay Kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015)
- . Miseq system use guide Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system (2016)
- Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
- Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
- Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
- Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
- Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244 (2020).
