Utilisation d’un baseplatage et d’un miniscope préancré avec une lentille objective pour la recherche transitoire de calcium chez la souris

Les rapporteurs d’activité fluorescents sont idéaux pour l’imagerie de l’activité neuronale car ils sont sensibles et ont de grandes plages dynamiques ^1,2,3. Par conséquent, un nombre croissant d’expériences utilisent la microscopie à fluorescence pour observer directement l’activité neuronale 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,16. Le premier microscope à fluorescence monophotonique miniaturisé (miniscope) a été conçu en 2011 par Mark Schnitzer et ^al.5. Ce miniscope permet aux chercheurs de surveiller la dynamique de fluorescence des cellules cérébelleuses chez les animaux^qui se comportent librement 5 (c’est-à-dire sans aucune contrainte physique, appuie-tête, sédation ou anesthésie pour les animaux). Actuellement, la technique peut être appliquée pour surveiller les zones superficielles du cerveau telles que le cortex 6,8,15,16; zones sous-corticales telles que l’hippocampe dorsal 8,11,13,14 et le striatum ^6,17; et les zones profondes du cerveau telles que l’hippocampe ventral 14, l’amygdale 10,18 et l’hypothalamus ^8,12.

Ces dernières années, plusieurs miniscopes open-source ont été développés^{4,5,6,7,11,13,17,19}. Le miniscope peut être assemblé économiquement par les chercheurs s’ils suivent les directives étape par étape fournies par l’équipe Miniscope de l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA).^4,7,11,13. Parce que la surveillance optique de l’activité neuronale est limitée par les limites de la transmission de la lumière⁷ vers et depuis la population neuronale d’intérêt, un miniscope a été conçu qui nécessite qu’une lentille d’indice de réfraction de gradient objectif (GRIN) (ou lentille objectif) soit préancrée au bas du miniscope pour agrandir le champ de vision relayé par une lentille GRIN relais (ou lentille relais)^{6,7,8,10,16,17}. Cette lentille relais est implantée dans la région cérébrale cible de sorte que l’activité de fluorescence de la région cérébrale cible est relayée sur la surface de la lentille relais^{6,7,8,10,16,17}. Environ 1/4 d’une période sinusoïdale complète de lumière traverse la lentille GRIN objective (~ 0,25 hauteur) (Graphique 1A1), ce qui donne une image de fluorescence agrandie^6,7. La lentille de l’objectif n’est pas toujours fixée au bas du miniscope et l’implantation de la lentille relais n’est pas nécessaire^6,7,11,13,15. Plus précisément, il existe deux configurations: une avec une lentille d’objectif fixe dans le miniscope et une lentille relais implantée dans le cerveau^{8,10,12,14,16} (Graphique 1B1) et un autre avec juste une lentille d’objectif amovible^6,7,11,13,15 (Figure 1B2). Dans la conception basée sur la combinaison de lentilles relais à objectif fixe et implantées, les signaux de fluorescence du cerveau sont amenés à la surface supérieure de la lentille relais (Graphique 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. Par la suite, la lentille de l’objectif peut agrandir et transmettre le champ visuel à partir de la surface supérieure de la lentille relais (Graphique 1A2). D’autre part, la conception de la lentille GRIN objectif amovible est plus flexible, ce qui signifie que la préimplantation d’une lentille relais dans le cerveau n’est pas obligatoire (Figure 1B2)^6,7,11,13,15. Lors de l’utilisation d’un miniscope basé sur une conception de lentille d’objectif amovible, les chercheurs doivent toujours implanter une lentille dans la région du cerveau cible, mais ils peuvent implanter une lentille d’objectif.^6,7,11,13,15 ou une lentille relais dans le cerveau^6,7. Le choix d’un objectif ou d’une lentille relais pour l’implantation détermine la configuration du miniscope que le chercheur doit utiliser. Par exemple, le V3 UCLA Miniscope est basé sur une conception d’objectif amovible GRIN. Les chercheurs peuvent choisir d’implanter directement une lentille d’objectif dans la région cérébrale d’intérêt et de monter le miniscope « vide » sur la lentille de l’objectif.^6,7,11,13,15 (un système à une seule lentille; Figure 1B2) ou d’implanter une lentille relais dans le cerveau et de monter un miniscope préancré avec une lentille objective^6,7 (un système à deux lentilles; Graphique 1B1). Le miniscope fonctionne ensuite comme une caméra à fluorescence pour capturer des images en direct de la fluorescence neuronale produite par un indicateur de calcium génétiquement codé^1,2,3. Une fois le miniscope connecté à un ordinateur, ces images de fluorescence peuvent être transférées sur l’ordinateur et enregistrées sous forme de clips vidéo. Les chercheurs peuvent étudier l’activité neuronale en analysant les changements relatifs de fluorescence avec certains progiciels d’analyse^20,21 ou écrire leurs codes pour une analyse future.

Le V3 UCLA Miniscope offre aux utilisateurs la flexibilité nécessaire pour déterminer s’ils doivent imager l’activité neuronale avec un système à une ou deux lentilles⁷. Le choix du système d’enregistrement est basé sur la profondeur et la taille de la zone cérébrale cible. En bref, un système à objectif unique ne peut imager qu’une zone superficielle (moins de 2,5 mm de profondeur environ) et relativement grande (plus grande qu’environ 1,8 x 1,8 mm²) parce que les fabricants ne produisent qu’une certaine taille de lentille d’objectif. En revanche, un système à deux lentilles peut être appliqué à n’importe quelle zone cérébrale cible. Cependant, le ciment dentaire pour coller la plaque de base a tendance à provoquer un désalignement avec une distance altérée entre l’objectif et les lentilles relais, ce qui entraîne une mauvaise qualité d’image. Si le système à deux lentilles est utilisé, deux distances de travail doivent être ciblées avec précision pour obtenir une qualité d’image optimale (Figure 1A). Ces deux distances de travail critiques se situent entre les neurones et la surface inférieure de la lentille relais, et entre la surface supérieure de la lentille relais et la surface inférieure de la lentille de l’objectif (Figure 1A1). Tout désalignement ou mauvais placement de la lentille en dehors de la distance de travail entraîne une défaillance de l’imagerie (Figure 1C2). En revanche, le système à objectif unique ne nécessite qu’une seule distance de travail précise. Cependant, la taille de la lentille de l’objectif limite son application pour la surveillance des régions profondes du cerveau (la lentille d’objectif qui s’adapte au miniscope est d’environ 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Par conséquent, l’implantation d’une lentille objective est limitée pour l’observation de la surface et de régions cérébrales relativement grandes, telles que le cortex 6,15 et le cornu ammonis dorsal 1 (CA1) chez la souris^[11,13]. De plus, une grande surface du cortex doit être aspirée pour cibler le CA1 dorsal^11,13. En raison de la limitation de la configuration à une lentille qui empêche l’imagerie des régions profondes du cerveau, les systèmes de miniscopes commerciaux n’offrent qu’une conception combinée objectif / lentille relais (deux lentilles). D’autre part, le miniscope V3 UCLA peut être modifié en un système à une ou deux lentilles car son objectif est amovible 6,11,13,15. En d’autres termes, les utilisateurs de miniscopes V3 UCLA peuvent tirer parti de la lentille amovible en l’implantant dans le cerveau (création d’un système à une lentille), lors d’expériences impliquant des observations cérébrales superficielles (moins de 2,5 mm de profondeur), ou en la préancrant dans le miniscope et en implantant une lentille relais dans le cerveau (création d’un système à deux lentilles), lors de la réalisation d’expériences impliquant des observations cérébrales profondes. Le système à deux lentilles peut également être appliqué pour observer superficiellement le cerveau, mais le chercheur doit connaître les distances de travail précises entre la lentille de l’objectif et la lentille relais. Le principal avantage du système à une lentille est qu’il y a moins de chances de manquer les distances de travail qu’avec un système à deux lentilles, étant donné que deux distances de travail doivent être ciblées avec précision pour obtenir une qualité d’image optimale dans le système à deux lentilles (Figure 1A). Par conséquent, nous recommandons d’utiliser un système à une lentille pour les observations superficielles du cerveau. Cependant, si l’expérience nécessite une imagerie dans la zone profonde du cerveau, le chercheur doit apprendre à éviter le désalignement des deux lentilles.

Le protocole de base pour la configuration à deux lentilles des miniscopes pour les expériences comprend l’implantation de lentilles et le placage de base 8,10,16,17. Le placage de base consiste à coller une plaque de base sur la tête d’un animal afin que le miniscope puisse éventuellement être monté sur le dessus de l’animal et filmer les signaux de fluorescence des neurones (Figure 1B). Cette procédure consiste à utiliser du ciment dentaire pour coller la plaque de base sur le crâne (Figure 1C), mais le retrait du ciment dentaire peut provoquer des changements inacceptables dans la distance entre la lentille relais implantée et la lentille objectif ^8,17. Si la distance décalée entre les deux lentilles est trop grande, les cellules ne peuvent pas être mises au point.

Des protocoles détaillés pour des expériences d’imagerie calcique cérébrale profonde utilisant des miniscopes ont déjà été publiés^8,10,16,17. Les auteurs de ces protocoles ont utilisé le système Inscopix^8,10,16 ou d’autres conceptions personnalisées¹⁷ et ont décrit les procédures expérimentales pour la sélection virale, la chirurgie et la fixation de la plaque de base. Cependant, leurs protocoles ne peuvent pas être appliqués avec précision à d’autres systèmes open source, tels que le système V3 UCLA Miniscope, NINscope⁶, et Finchscope¹⁹. Un désalignement des deux lentilles peut se produire pendant l’enregistrement dans une configuration à deux lentilles avec un miniscope UCLA en raison du type de ciment dentaire utilisé pour cimenter la plaque de base au crâne^8,17 (Graphique 1C). Le protocole actuel est nécessaire parce que la distance entre la lentille relais implantée et la lentille objectif est susceptible de se déplacer en raison du retrait indésirable du ciment dentaire pendant la procédure de baseplatage. Pendant le placage, la distance de travail optimale entre la lentille relais implantée et la lentille de l’objectif doit être trouvée en ajustant la distance entre le miniscope et le haut de la lentille relais, et la plaque de base doit ensuite être collée à cet endroit idéal. Une fois la distance correcte entre la lentille de l’objectif et la lentille relais implantée est définie, des mesures longitudinales peuvent être obtenues à la résolution cellulaire (Graphique 1B; in vivo enregistrement). Étant donné que la plage optimale de distances de travail d’une lentille relais est faible (50 – 350 μm)^4,8, un retrait excessif du ciment pendant le durcissement peut rendre difficile le maintien de la lentille de l’objectif et de la lentille relais implantée dans la plage appropriée. L’objectif global de ce rapport est de fournir un protocole pour réduire les problèmes de retrait^8,17 qui se produisent pendant la procédure de baseplatage et pour augmenter le taux de réussite des enregistrements miniscopiques de signaux de fluorescence dans une configuration à deux lentilles. L’enregistrement réussi d’un miniscope est défini comme l’enregistrement d’un flux en direct de changements relatifs notables dans la fluorescence de neurones individuels chez un animal qui se comporte librement. Bien que différentes marques de ciment dentaire aient des taux de retrait différents, les chercheurs peuvent sélectionner une marque qui a déjà été testée.^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. Cependant, toutes les marques ne sont pas faciles à obtenir dans certains pays / régions en raison des réglementations d’importation pour les matériaux médicaux. Par conséquent, nous avons développé des méthodes pour tester les taux de retrait des ciments dentaires disponibles et, surtout, fournir un protocole alternatif qui minimise le problème de retrait. L’avantage par rapport au protocole actuel de baseplatage est une augmentation du taux de réussite de l’imagerie calcique avec des outils et du ciment qui peuvent être facilement obtenus dans les laboratoires. Le miniscope UCLA est utilisé comme exemple, mais le protocole est également applicable à d’autres miniscopes. Dans ce rapport, nous décrivons une procédure de baseplacage optimisée et recommandons également certaines stratégies pour l’installation du système à deux lentilles miniscope de l’UCLA (Graphique 2A). Des exemples d’implantation réussie (n = 3 souris) et des exemples d’implantation ratée (n = 2 souris) pour la configuration à deux lentilles avec le miniscope UCLA sont présentés avec les discussions sur les raisons des succès et des échecs.