استخدام الطلاء الأساسي ومنظار صغير مثبت مسبقا بعدسة موضوعية لأبحاث الكالسيوم العابرة في الفئران

تعتبر مراسلات النشاط الفلوري مثالية لتصوير النشاط العصبي لأنها حساسة ولها نطاقات ديناميكية كبيرة¹،^2،3. لذلك ، يستخدم عدد متزايد من التجارب الفحص المجهري الفلوري لمراقبة النشاط العصبي مباشرة¹،²،³،⁴،⁵،⁶،^7،8،⁹،¹⁰،^11،12،¹³،^{14،15 ، 16}. تم تصميم أول مجهر مضان مصغر أحادي الفوتون (miniscope) في عام 2011 بواسطة Mark Schnitzer et ^al.5. يمكن هذا المنظار الصغير الباحثين من مراقبة ديناميكيات التألق للخلايا المخيخية في الحيوانات التي تتصرف بحرية⁵ (أي دون أي تقييد جسدي أو تقييد للرأس أو تخدير أو تخدير للحيوانات). حاليا ، يمكن تطبيق هذه التقنية لمراقبة مناطق الدماغ السطحية مثل القشرة⁶،⁸،^15،16. المناطق تحت القشرية مثل الحصين الظهري⁸،^11،13،¹⁴ والمخطط^6،17 ؛ ومناطق الدماغ العميقة مثل الحصين البطني¹⁴ واللوزة¹⁰،18 ، وما تحت المهاد^8،12.

في السنوات الأخيرة ، تم تطوير العديد من المناظير مفتوحة المصدر^{4,5,6,7,11,13,17,19}. يمكن تجميع المنظار الصغير اقتصاديا من قبل الباحثين إذا اتبعوا الإرشادات خطوة بخطوة المقدمة من فريق Miniscope بجامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس (UCLA)^4,7,11,13. لأن المراقبة البصرية للنشاط العصبي مقيدة بقيود انتقال الضوء⁷ من وإلى المجموعة العصبية ذات الاهتمام ، تم تصميم منظار صغير يتطلب عدسة معامل الانكسار المتدرج الموضوعي (GRIN) (أو العدسة الموضوعية) ليتم تثبيتها مسبقا في الجزء السفلي من المنظار المصغر لتكبير مجال الرؤية الذي يتم ترحيله من عدسة GRIN التتابع (أو عدسة الترحيل)^{6,7,8,10,16,17}. يتم زرع عدسة التتابع هذه في منطقة الدماغ المستهدفة بحيث يتم نقل نشاط التألق لمنطقة الدماغ المستهدفة على سطح عدسة التتابع^{6,7,8,10,16,17}. ينتقل ما يقرب من 1/4 من فترة الضوء الجيبية الكاملة عبر عدسة GRIN الموضوعية (~ 0.25 درجة) (الشكل 1A1)، مما أدى إلى صورة مضان مكبرة^6,7. لا يتم تثبيت العدسة الشيئية دائما في الجزء السفلي من المنظار الصغير ولا يلزم زرع عدسة التتابع^6,7,11,13,15. على وجه التحديد ، هناك تكوينان: أحدهما بعدسة موضوعية ثابتة في المنظار الصغير وعدسة ترحيل مزروعة في الدماغ^{8,10,12,14,16} (الشكل 1B1) وآخر مع عدسة موضوعية قابلة للإزالة فقط^6,7,11,13,15 (الشكل 1B2). في التصميم القائم على الهدف الثابت ومجموعة عدسات الترحيل المزروعة ، يتم إحضار إشارات التألق من الدماغ إلى السطح العلوي لعدسة التتابع (الشكل 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. بعد ذلك ، يمكن للعدسة الشيئية تكبير المجال البصري ونقله من السطح العلوي لعدسة الترحيل (الشكل 1 أ 2). من ناحية أخرى ، فإن تصميم عدسة GRIN الموضوعي القابل للإزالة أكثر مرونة ، مما يعني أن الزرع المسبق لعدسة التتابع في الدماغ ليس إلزاميا (الشكل 1B2)^6,7,11,13,15. عند استخدام منظار صغير يعتمد على تصميم عدسة موضوعية قابلة للإزالة ، لا يزال الباحثون بحاجة إلى زرع عدسة في منطقة الدماغ المستهدفة ولكن يمكنهم إما زرع عدسة موضوعية^6,7,11,13,15 أو عدسة ترحيل في الدماغ^6,7. يحدد اختيار الهدف أو عدسة التتابع للزرع تكوين المنظار المصغر الذي يجب على الباحث استخدامه. على سبيل المثال ، يعتمد V3 UCLA Miniscope على تصميم عدسة GRIN موضوعي قابل للإزالة. يمكن للباحثين اختيار إما زرع عدسة موضوعية مباشرة في منطقة الدماغ محل الاهتمام وتركيب المنظار الصغير “الفارغ” على العدسة الشيئية^6,7,11,13,15 (نظام عدسة واحدة؛ الشكل 1B2) أو لزرع عدسة ترحيل في الدماغ وتركيب منظار صغير مثبت مسبقا بعدسة موضوعية^6,7 (نظام ثنائي العدسة؛ الشكل 1B1). ثم يعمل المنظار الصغير ككاميرا مضان لالتقاط صور البث المباشر للتألق العصبي الناتج عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا^1,2,3. بعد توصيل miniscope بجهاز كمبيوتر ، يمكن نقل صور التألق هذه إلى الكمبيوتر وحفظها كمقاطع فيديو. يمكن للباحثين دراسة النشاط العصبي من خلال تحليل التغيرات النسبية في التألق مع بعض حزم التحليل^20,21 أو اكتب رموزهم للتحليل المستقبلي.

يوفر V3 UCLA Miniscope المرونة للمستخدمين لتحديد ما إذا كانوا يريدون تصوير النشاط العصبي باستخدام نظام أحادي أو ثنائي العدسة⁷. يعتمد اختيار نظام التسجيل على عمق وحجم منطقة الدماغ المستهدفة. باختصار ، يمكن لنظام العدسة الواحدة فقط تصوير منطقة سطحية (أقل من عمق 2.5 مم تقريبا) وكبيرة نسبيا (أكبر من 1.8 × 1.8 مم² تقريبا) لأن الشركات المصنعة تنتج فقط حجما معينا من العدسة الموضوعية. في المقابل ، يمكن تطبيق نظام ثنائي العدسة على أي منطقة دماغية مستهدفة. ومع ذلك ، فإن الأسمنت السني للصق الصفيحة يميل إلى التسبب في اختلال المحاذاة مع تغيير المسافة بين الهدف وعدسات الترحيل ، مما يؤدي إلى جودة صورة رديئة. إذا تم استخدام نظام العدستين ، فيجب استهداف مسافتين للعمل بدقة لتحقيق جودة التصوير المثلى (الشكل 1 أ). هاتان المسافتان الحرجتان للعمل هما بين الخلايا العصبية والسطح السفلي لعدسة الترحيل ، وبين السطح العلوي لعدسة الترحيل والسطح السفلي للعدسة الشيئية (الشكل 1A1). يؤدي أي اختلال في محاذاة العدسة أو وضعها في غير موضعها خارج مسافة العمل إلى فشل التصوير (الشكل 1C2). في المقابل ، يتطلب نظام العدسة الواحدة مسافة عمل دقيقة واحدة فقط. ومع ذلك ، فإن حجم العدسة الموضوعية يحد من تطبيقها لمراقبة مناطق الدماغ العميقة (العدسة الموضوعية التي تناسب المنظار الصغير هي حوالي 1.8 ~ 2.0 مم⁶،¹¹،^13،15). لذلك ، فإن زرع عدسة موضوعية محدود لمراقبة السطح ومناطق الدماغ الكبيرة نسبيا ، مثل القشرة^6,15 والقرنية الظهرية ammonis 1 (CA1) في الفئران^11,13 . بالإضافة إلى ذلك ، يجب استنشاق مساحة كبيرة من القشرة لاستهداف الظهرية CA1^11,13. نظرا لمحدودية تكوين العدسة الواحدة الذي يمنع تصوير مناطق الدماغ العميقة ، فإن أنظمة المنظار الصغير التجارية لا تقدم سوى تصميم عدسة موضوعية / عدسة ترحيل (عدستان). من ناحية أخرى ، يمكن تعديل المنظار المصغر V3 UCLA إلى نظام أحادي العدسة أو عدستين لأن عدسته الموضوعية قابلة للإزالة⁶،^11،13،15. بمعنى آخر ، يمكن لمستخدمي V3 UCLA miniscope الاستفادة من العدسة القابلة للإزالة عن طريق زرعها في الدماغ (إنشاء نظام عدسة واحدة) ، عند إجراء تجارب تتضمن ملاحظات دماغية سطحية (أقل من 2.5 مم في العمق) ، أو عن طريق تثبيتها مسبقا في المنظار الصغير وزرع عدسة ترحيل في الدماغ (إنشاء نظام ثنائي العدسات) ، عند إجراء التجارب التي تنطوي على ملاحظات الدماغ العميقة. يمكن أيضا تطبيق نظام العدستين لمراقبة الدماغ بشكل سطحي ، ولكن يجب على الباحث معرفة مسافات العمل الدقيقة بين العدسة الشيئية وعدسة الترحيل. الميزة الرئيسية لنظام العدسة الواحدة هي أن هناك فرصة أقل لفقدان مسافات العمل مقارنة بنظام العدستين ، نظرا لوجود مسافتين للعمل يجب استهدافهما بدقة لتحقيق جودة التصوير المثلى في نظام العدستين (الشكل 1 أ). لذلك ، نوصي باستخدام نظام عدسة واحدة لملاحظات الدماغ السطحية. ومع ذلك ، إذا كانت التجربة تتطلب التصوير في منطقة الدماغ العميقة ، فيجب على الباحث أن يتعلم تجنب اختلال العدسات.

يتضمن البروتوكول الأساسي لتكوين العدسة الثنائية للمناظير للتجارب زرع العدسة والطلاء الأساسي⁸،¹⁰،^16،17. الطلاء الأساسي هو لصق صفيحة أساسية على رأس بحيث يمكن تركيب المنظار الصغير في النهاية فوق الحيوان وتصوير إشارات التألق للخلايا العصبية بالفيديو (الشكل 1 ب). يتضمن هذا الإجراء استخدام الأسمنت السني لصق الصفيحة على الجمجمة (الشكل 1C) ، لكن انكماش الأسمنت السني يمكن أن يسبب تغييرات غير مقبولة في المسافة بين عدسة الترحيل المزروعة والعدسة الموضوعية ^8,17. إذا كانت المسافة المتحولة بين العدستين كبيرة جدا ، فلا يمكن التركيز على الخلايا.

تم بالفعل نشر بروتوكولات مفصلة لتجارب تصوير الكالسيوم في الدماغ العميق باستخدام المناظير^8,10,16,17. استخدم مؤلفو هذه البروتوكولات نظام Inscopix^8,10,16 أو غيرها من التصاميم المخصصة¹⁷ ووصفت الإجراءات التجريبية للانتقاء الفيروسي والجراحة وربط الصفيحة الأساسية. ومع ذلك ، لا يمكن تطبيق بروتوكولاتهم بدقة على أنظمة أخرى مفتوحة المصدر ، مثل نظام V3 UCLA Miniscope ، NINscope⁶، وفينسكوب¹⁹. يمكن أن يحدث اختلال في محاذاة العدستين أثناء التسجيل في تكوين ثنائي العدسة باستخدام UCLA Miniscope بسبب نوع الأسمنت السني المستخدم لتثبيت الصفيحة الأساسية في الجمجمة^8,17 (الشكل 1 ج). هناك حاجة إلى البروتوكول الحالي لأن المسافة بين عدسة الترحيل المزروعة والعدسة الموضوعية عرضة للتحول بسبب الانكماش غير المرغوب فيه لأسمنت الأسنان أثناء إجراء الطلاء الأساسي. أثناء الطلاء الأساسي ، يجب العثور على مسافة العمل المثلى بين عدسة الترحيل المزروعة والعدسة الموضوعية عن طريق ضبط المسافة بين المنظار الصغير وأعلى عدسة الترحيل ، ويجب بعد ذلك لصق الصفيحة الأساسية في هذا الموقع المثالي. بعد ضبط المسافة الصحيحة بين العدسة الشيئية وعدسة الترحيل المزروعة ، يمكن الحصول على قياسات طولية بدقة خلوية (الشكل 1 ب; in vivo تسجيل). نظرا لأن النطاق الأمثل لمسافات العمل لعدسة التتابع صغير (50 – 350 ميكرومتر)^4,8، يمكن أن يؤدي الانكماش المفرط للأسمنت أثناء المعالجة إلى صعوبة الحفاظ على العدسة الموضوعية وعدسة الترحيل المزروعة ضمن النطاق المناسب. الهدف العام من هذا التقرير هو توفير بروتوكول للحد من مشاكل الانكماش^8,17 التي تحدث أثناء إجراء الطلاء الأساسي ولزيادة معدل نجاح تسجيلات miniscope لإشارات التألق في تكوين ثنائي العدسات. يتم تعريف تسجيل miniscope الناجح على أنه تسجيل بث مباشر للتغيرات النسبية الملحوظة في مضان الخلايا العصبية الفردية في يتصرف بحرية. على الرغم من أن العلامات التجارية المختلفة لأسمنت الأسنان لها معدلات انكماش مختلفة ، يمكن للباحثين اختيار علامة تجارية تم اختبارها مسبقا^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. ومع ذلك ، ليس من السهل الحصول على كل علامة تجارية في بعض البلدان / المناطق بسبب لوائح استيراد المواد الطبية. لذلك ، قمنا بتطوير طرق لاختبار معدلات انكماش الأسمنت السني المتاح ، والأهم من ذلك توفير بروتوكول بديل يقلل من مشكلة الانكماش. الميزة على بروتوكول الطلاء الأساسي الحالي هي زيادة معدل نجاح تصوير الكالسيوم بالأدوات والأسمنت التي يمكن الحصول عليها بسهولة في المختبرات. يتم استخدام منظار UCLA المصغر كمثال ، ولكن البروتوكول ينطبق أيضا على المناظير الأخرى. في هذا التقرير ، نصف إجراء طلاء أساسي محسن ونوصي أيضا ببعض الاستراتيجيات لتركيب نظام UCLA miniscope ثنائي العدسة (الشكل 2 أ). يتم تقديم كل من أمثلة الزرع الناجح (ن = 3 فئران) وأمثلة على الزرع الفاشل (ن = 2 فئران) للتكوين ثنائي العدسة مع منظار UCLA المصغر جنبا إلى جنب مع المناقشات لأسباب النجاح والفشل.